急性呼吸窘迫综合征（ARDS）高炎症与低炎症亚表型的血清蛋白质组特征及细胞表达映射

《Journal of Intensive Care》：Subphenotype-specific serum proteomic signatures in patients with ARDS

背景：急性呼吸窘迫综合征（ARDS）伴随显著的疾病负担和死亡风险。既往研究已识别出可重复的高炎症和低炎症ARDS亚表型，其临床结局和治疗反应不同。尽管近期转录组学研究为这些亚表型之间的生物学差异提供了见解，但循环蛋白质组的作用仍未完全阐明。

方法：在这项前瞻性研究中，研究人员使用既往验证的3变量分类器，将ARDS患者分类为高炎症或低炎症亚表型，该分类器基于碳酸氢盐、白介素-6（IL-6）和可溶性肿瘤坏死因子受体1（sTNFR1）。研究人员进行血清蛋白质组分析，以识别亚表型之间差异丰度蛋白。研究人员使用基因集富集分析（GSEA）检查生物学通路。为提供亚表型相关血清蛋白的细胞表达背景，研究人员将血清蛋白质组数据映射至公开可用的外周血单核细胞（PBMC）、中性粒细胞和气管抽吸物单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。

结果：在31例ARDS患者中，13例（42%）被分类为高炎症亚表型，18例（58%）为低炎症亚表型。高炎症亚表型的28天死亡率和住院死亡率均高于低炎症亚表型（46% vs. 11%，P=0.04；62% vs. 11%，P=0.01）。总计54种血清蛋白在亚表型之间差异丰度。这些蛋白代表生物学相关类别，包括内皮损伤、免疫调节、凝血/纤溶、补体调节、组织重塑和代谢相关蛋白。基因集富集分析识别出亚表型之间差异富集的通路，包括细胞黏附、细胞–细胞信号传导和细胞因子反应（所有FDR < 0.10）。在外部单细胞RNA测序参考数据集中，编码亚表型相关蛋白的基因主要表达于PBMC中的CD14和CD16单核细胞，在未成熟和CD163⁺IL1R2^hi循环中性粒细胞状态中显示不同表达模式，并在气管抽吸物中主要表达于巨噬细胞和单核细胞群体，同时存在额外上皮表达。结论：血清蛋白质组分析识别出与已建立ARDS炎症亚表型相关的不同蛋白模式，为ARDS生物学异质性提供了见解。

研究背景：急性呼吸窘迫综合征（ARDS，一种由弥漫性肺炎症和水肿引起的急性低氧性呼吸衰竭临床综合征）尽管支持治疗不断进步，仍伴随高发病率和死亡率，报道死亡率约为40%。越来越多证据提示，ARDS并非单一生物学实体，而是包含不同炎症谱、临床结局以及可能治疗反应差异的异质性综合征。然而，ARDS亚表型背后的生物学机制仍未完全阐明。蛋白质作为介质、生物标志物和潜在治疗靶点发挥重要作用。循环血清蛋白反映与ARDS相关的多种生物学过程，包括上皮和内皮损伤、炎症及凝血。尽管近期转录组学研究推进了对ARDS亚表型相关细胞程序的理解，但mRNA谱不一定反映蛋白丰度、转录后调控或循环效应分子。因此，蛋白质组分析可能为ARDS亚表型提供补充性和临床相关见解。尽管如此，应用血清蛋白质组学描绘已建立ARDS亚表型病理生物学的相关研究仍有限。为填补这一知识空白，研究人员调查与ARDS亚表型相关的血清蛋白质组特征，并假设血清蛋白质组分析可揭示ARDS亚表型背后的生物学通路，并提供与ARDS精准医学相关的机制见解。

研究人员开展的研究：这是一项前瞻性研究，纳入广岛大学医院（Hiroshima University Hospital）重症监护病房（ICU）2016年3月至2018年2月接受机械通气且具有残余血清样本可供蛋白质组分析的成人ARDS患者；ARDS按柏林标准临床定义，年龄小于18岁者排除。研究方案获广岛大学医院机构审查委员会批准。因使用临床目的采集的残余血样，知情同意要求被豁免。研究人员收集人口学和临床数据，包括年龄、性别、基础临床状况、实验室数据以及ICU入院时的序贯器官衰竭评估（SOFA）和急性生理与慢性健康评分II（APACHE II）。研究人员还记录ICU期间治疗和住院死亡率。血清样本在ARDS诊断后24小时内采集，并同时采集广岛大学医院招募的健康研究志愿者样本。ARDS患者中，IL-6和sTNFR1浓度用酶联免疫吸附试验测定。ARDS亚表型由基于IL-6、sTNFR1和碳酸氢盐的既往验证3变量分类器模型确定，预测为高炎症亚表型的概率大于0.5者归为高炎症亚表型，其余归为低炎症亚表型。血清蛋白质组分析采用基于尿素的蛋白提取，随后进行酶切、肽段净化，并使用Vanquish Neo UHPLC系统与ZenoTOF 7600质谱仪联用进行ZenoSWATH-MS采集；蛋白鉴定和SWATH数据定量通过无文库搜索、人类FASTA和DIA-NN 2.0.2完成。统计分析中，蛋白质组数据排除无法映射到基因符号的蛋白和所有样本中缺失值超过30%的蛋白，缺失值用missForest R包插补，蛋白丰度值随后进行log₂转换。高炎症与低炎症亚表型之间差异丰度蛋白用limma R包识别，定义假发现率（FDR）<0.10且绝对log₂倍数变化≥0.59，对应约1.5倍差异。与健康对照比较使用log₂倍数变化和方向一致性进行描述性总结。对28天存活者与非存活者之间差异丰度蛋白进行探索性分析，使用limma并校正APACHE II评分。为表征与ARDS亚表型相关的生物学通路，研究人员使用fgsea R包，基于所有定量蛋白的排序列表，结合Gene Ontology生物学过程基因集和MSigDB HALLMARK基因集进行GSEA。为提供差异丰度蛋白的外部细胞表达背景，研究人员将差异丰度蛋白映射至公开可用的PBMC、全血和下呼吸道样本单细胞RNA测序数据集（GEO：GSE151263；GEO：GSE157789；GEO：GSE200848）。其中GSE157789分析限于非COVID细菌性ARDS患者ICU入院72小时内采集的循环中性粒细胞，并使用原研究者提供的细胞状态注释。研究人员进行敏感性分析：第一，校正APACHE II评分后重新评估ARDS亚表型间差异丰度蛋白；第二，排除与临床IL-6或sTNFR1存在名义显著Spearman相关（P<0.05）的蛋白，并用剩余蛋白重复Gene Ontology生物学过程GSEA。统计分析使用R 4.4.1，使用Benjamini–Hochberg FDR方法考虑多重检验。结论是血清蛋白质组分析识别出与已建立ARDS炎症亚表型相关的不同蛋白模式，为ARDS生物学异质性提供见解；该研究意义在于从血清蛋白层面补充转录组认识，并为亚表型相关蛋白模式的未来纵向研究提供基础。

关键技术与方法概述（不超过250字）：研究样本来自广岛大学医院ICU 2016年3月至2018年2月接受机械通气的成人ARDS患者及健康研究志愿者；外部单细胞参考数据来自GEO GSE151263、GSE157789和GSE200848，其中GSE157789限于非COVID细菌性ARDS患者ICU入组72小时内循环中性粒细胞。关键技术包括：基于碳酸氢盐、IL-6和sTNFR1的3变量分类器进行亚表型分类；ZenoSWATH-MS血清蛋白质组分析，DIA-NN进行无文库鉴定和定量；limma识别差异丰度蛋白；fgsea进行Gene Ontology和HALLMARK基因集富集分析；将差异蛋白映射至公开PBMC、中性粒细胞和气管抽吸物单细胞RNA测序数据以提供细胞表达背景。

研究结果：1. 患者特征与结局（Patient characteristics and outcomes）。共有31例ARDS患者和5例健康对照接受蛋白质组分析。ARDS患者中位年龄为67岁（四分位距59–76岁），22例（71%）为男性。中位SOFA和APACHE II评分分别为9和28。按柏林定义，5例（16%）为轻度ARDS，13例（42%）为中度ARDS，13例（42%）为重度ARDS。从ARDS危险因素发生到ARDS发生的中位间隔为2天。基于3变量分类器，13例为高炎症亚表型，18例为低炎症亚表型。高炎症亚表型患者体重指数和碳酸氢盐水平较低，SOFA和APACHE II评分较高（均P<0.05）。总体8例（26%）在28天内死亡，10例（32%）住院期间死亡。高炎症亚表型28天死亡率和住院死亡率均显著高于低炎症亚表型（46% vs. 11%，P=0.04；62% vs. 11%，P=0.01）。2. 亚表型特异性蛋白与通路（Subphenotype-specific proteins and pathways）。蛋白质组分析在ARDS患者和健康对照中测量861种血清蛋白。未过滤输出中3种因无法映射至基因符号被排除，421种因所有样本中缺失值超过30%被排除，最终437种蛋白保留用于下游分析。与健康对照描述性比较中，437种蛋白中176种在ARDS队列中绝对log₂倍数变化≥0.59。热图显示高炎症、低炎症亚表型和健康对照之间存在不同蛋白质组模式。高炎症与低炎症ARDS亚表型之间共有54种血清蛋白差异丰度。校正APACHE II评分敏感性分析中，原54种蛋白中30种仍显著，所有54种蛋白关联方向未变。阈值敏感性分析中，54种蛋白中46种（85%）在FDR <0.05时仍显著。与健康对照描述性比较中，437种蛋白中353种（80.8%）在高炎症–对照和低炎症–对照比较中变化方向相同；在高炎症–对照、低炎症–对照和ARDS–对照三个比较中绝对log₂倍数变化均≥0.59的121种蛋白均方向一致。探索性分析识别出8种与28天死亡率相关的蛋白，SERPINE1与54种亚表型相关蛋白重叠。亚表型间差异丰度蛋白包括参与多个生物学相关类别的蛋白，包括内皮损伤（如VCAM1、NRP1）、免疫调节（如CD163、CSF1R、VSIG4）、凝血（如PLG、SERPINE1）、补体调节（如C3、C6、CLU）、组织重塑（如LCN2、CHI3L1、TIMP1）和代谢失调（如APOB、APOC4、IGFBP4、SELENOP）。在独立血清蛋白质组研究报告的9种亚表型间差异蛋白中，3种（PTGDS、NRP1、SERPIND1）与本研究54种蛋白集重叠，且三者在两项研究中方向一致。GSEA识别出171个在高炎症与低炎症亚表型间显著富集的Gene Ontology生物学过程条目（所有FDR<0.10）。值得注意的是，MAPK级联、细胞–细胞黏附和细胞因子反应相关通路显著富集。GSEA还识别出9个差异富集的HALLMARK条目（所有FDR<0.10），凝血、上皮间质转化、顶端连接和糖酵解显著富集。敏感性分析中，排除437种中与临床IL-6或sTNFR1存在名义显著相关的168种蛋白后，GSEA识别出65个显著富集的Gene Ontology生物学过程条目，包括细胞黏附、细胞–细胞信号传导和细胞因子反应，而MAPK相关条目未显著富集。3. 外部scRNA-seq数据中的细胞表达背景（Cellular expression context in external scRNA-seq data）。为提供亚表型相关血清蛋白的细胞表达背景，研究人员将ARDS亚表型间差异丰度蛋白映射至外部PBMC、循环中性粒细胞和气管抽吸物scRNA-seq数据。在PBMC中，许多映射蛋白的编码基因优先表达于单核细胞簇，涵盖CD14和CD16单核细胞区室。CSF1R在CD16单核细胞中表达较高，而LYZ、CD44、NRP1和CD163在CD14单核细胞中更突出。TIMP1和VSIG4在CD14和CD16单核细胞簇中均表达。若干映射基因也在T细胞簇中富集，包括CD59和IGFBP4。在中性粒细胞中，LCN2、PRTN3、CHI3L1和LYZ在CD24⁺ARG1^hi未成熟中性粒细胞中显示相对高表达，而CD163、CD44、CD59和CD93优先表达于CD163⁺IL1R2^hi中性粒细胞。在气管抽吸物scRNA-seq数据中，编码映射蛋白的基因主要表达于肺泡巨噬细胞、单核细胞来源巨噬细胞和单核细胞，并在中性粒细胞和上皮区室中有额外信号。与固有免疫和组织重塑相关的基因，包括VSIG4、CSF1R、CD44、FCGR3A、TIMP1、LYZ和CD163，在髓系谱系群体中显著表达，而若干基因如LCN2在上皮区室中表达更强。

讨论部分总结：研究人员基于ARDS患者血清蛋白质组数据，识别出与已建立ARDS亚表型相关的不同蛋白质组谱。除高炎症ARDS已知的炎症和血管特征外，该分析识别出涉及免疫调节、组织重塑、补体调节、凝血和纤溶以及代谢改变的血清蛋白模式。外部单细胞RNA测序参考数据集显示，若干亚表型相关蛋白的编码基因表达于循环CD14和CD16单核细胞、不同循环中性粒细胞状态以及下呼吸道单核细胞/巨噬细胞群体。这些发现提示，高炎症ARDS可能与协调的免疫调节蛋白模式相关，而非单纯炎症放大。ARDS传统上被视为单一疾病实体，但既往研究已证明可重复的高炎症和低炎症亚表型。后续多组学研究开始阐明高炎症ARDS生物学。与本研究一致，近期血液转录组分析报道高炎症亚表型与固有免疫激活、组织重塑和代谢功能障碍相关。在单分子水平，LCN2在高炎症亚表型中也更高。近期纵向血液转录组和代谢研究同样提示高炎症与低炎症ARDS亚表型之间免疫、代谢和线粒体通路不同。在下呼吸道，高炎症ARDS与干扰素信号、粒细胞生成和T细胞激活增加相关。血液转录组研究还显示，若干分类定义血浆蛋白与其相应白细胞转录本不相关，提示循环蛋白可能捕获全血基因表达未完全反映的生物学。本研究优势在于使用非靶向血清蛋白质组学，不限于预设候选蛋白，能够同时评估广泛循环蛋白。区分亚表型的蛋白中，若干生物学程序参与高炎症ARDS。首先，CSF1R、CD163、VSIG4和TIMP1等蛋白与单核细胞/巨噬细胞生物学和免疫调节相关，提示高炎症亚表型涉及免疫调节特征。近期单细胞研究报道CD163/LGMN肺泡巨噬细胞与死亡率相关。VSIG4被描述为免疫调节性巨噬细胞相关补体受体。外部单细胞RNA测序参考数据中，若干相应基因也表达于髓系群体。然而，这些描述性映射不能确定所测血清蛋白的细胞来源，也不能确定ARDS亚表型之间细胞丰度或状态差异。通路分析显示MAPK信号、细胞黏附和细胞因子反应通路富集，提示高炎症ARDS中协调的炎症信号和细胞间通讯改变。在排除与IL-6或sTNFR1相关蛋白的敏感性分析中，MAPK相关富集未达显著性阈值，提示MAPK信号与用于亚表型分类的炎症生物标志物密切一致。其次，SERPINE1和CLU等蛋白提示凝血和补体调节程序。SERPINE1丰度较高与纤溶平衡受损一致，因为PAI-1增加与ALI/ARDS不良结局相关。CLU丰度较低可能提示细胞保护能力降低和终末补体复合物形成调节改变。与此解释一致，clusterin已被显示可中和细胞外组蛋白。第三，LCN2和若干代谢相关蛋白提示上皮应激、中性粒细胞相关损伤和代谢适应程序。LCN2与急性肺炎症和氧化应激相关，既往工作支持LCN2在肺损伤通路中的作用。总体而言，血清蛋白质组学通过识别更广泛的免疫调节蛋白模式以及已知凝血、补体和血管损伤通路，拓展了对高炎症ARDS的认识。局限性包括：样本量有限，效应量可能被高估，需更大队列独立验证；分析血清而非肺区室样本，血清蛋白质组学不能直接确定组织或细胞来源；外部单细胞RNA测序参考数据集来自独立队列并提供细胞转录组数据而非血清蛋白测量，转录丰度不一定对应循环蛋白丰度，这些分析应视为假设生成性而非循环蛋白细胞来源证据；亚表型分类和蛋白质组分析在单一早期时间点进行，无法评估亚表型纵向转换或相关蛋白质组模式变化；研究为单中心，可能限制普遍性，需多中心队列外部验证。

研究结论部分翻译：基于ARDS患者血清蛋白质组数据，研究人员识别出与高炎症亚表型相关的不同蛋白质特征。除高炎症ARDS已知的炎症和血管特征外，高炎症亚表型与更广泛的免疫调节蛋白模式以及补体和纤溶改变相关。对外部单细胞RNA测序参考数据集的检查为相应基因提供了描述性细胞表达背景。这些发现推进了ARDS亚表型生物学的血清蛋白层面认识，并为未来关于亚表型相关蛋白模式的生物学和临床相关性的纵向研究提供了基础。