冲积过滤作为一种可规模化且安全的单次使用技术用于病毒载体收获

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Alluvial filtration as a scalable and safe single-use technology for the harvest of viral vectors

　　

摘要专业翻译 基因治疗的最新进展增加了对大规模生产工艺的需求。重组腺相关病毒（rAAV）载体作为基因递送中使用的主要载体，其生产需要高效且可规模化的生产工艺，并且必须符合高安全标准。为实现全封闭系统操作，必须完全使用单次使用材料和设备。本研究报道了冲积过滤用于澄清不同生产规模下裂解的rAAV载体生产培养物的应用。在小规模实验（1–3 L进料）中，研究人员开发的内部方法在澄清性能方面优于合成深层过滤器，包括过滤容量、浊度降低、产物回收率和杂质去除率。针对500 L收获物的放大计算表明，冲积过滤可以在全封闭系统内提供所需的过滤面积和容量，而深层过滤器则无法实现。使用不同rAAV载体变体处理10 L、100 L和500 L规模的实际放大数据证实了冲积过滤方法的可放大性，并在澄清性能方面取得了优异结果。此外，系统尚未达到完全过滤容量和极限，表明该工艺对不同进料组成的稳健性。通过实施增强的监测和控制以降低故障和泄漏风险，支持了所建立的冲积过滤流程的安全性。总体而言，在生物制药生产工艺中，冲积过滤用于rAAV载体收获被证明优于已建立的深层过滤器。 关键要点 • 大规模病毒载体生产（>100 L）以满足日益增长的基因治疗需求 • 冲积过滤在高效收获澄清方面优于深层过滤器 • 冲积过滤具备在封闭系统中放大至500 L生产的容量

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一、研究背景与问题

基因治疗能够通过单次治疗替换、沉默或添加基因，从根本上解决疾病的遗传病因，有望消除对持续用药的需求。近年来基因治疗的进展及其日益普及，导致对基因治疗药物大规模制造的需求不断增长。在基于病毒载体的基因递送方法中，重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated viral, rAAV）载体已成为首选载体，目前已有多种基于rAAV载体的治疗药物上市。

rAAV载体的制造需要高安全标准，尤其对于风险等级2（根据德国中央生物安全委员会分类）的rAAV载体变体，法规要求采用全封闭系统。因此，能够降低暴露风险的单次使用技术备受青睐。在典型的制造工艺中，上游通过转染人胚胎肾293（HEK293）细胞进行生产，下游采用基于色谱的纯化，收获环节作为界面步骤，是将rAAV载体从宿主细胞及其碎片中释放并分离的关键初始步骤，同时要求载体损失最小化。

澄清步骤通常在小规模（最高10 L）下通过高离心力的离心法完成，但该方法不适用于放大生产，因为现有的单次使用离心方法缺乏在所需离心力下高效澄清裂解物的技术能力。过滤方法提供了一种经济高效且易于放大的替代方案，但粗细胞裂解物可能带来特殊挑战。深层过滤器因其高截留容量而被认为适合初级澄清，但自包含式胶囊的过滤面积受限，可能影响全封闭系统中的放大应用。中试操作通常需要基于滤芯支架的盒式方案，但其连接方式与全封闭处理不兼容。

冲积过滤（alluvial filtration），也称为体进料过滤（body feed filtration），是一种可能的替代方案。该方法将硅藻土（diatomaceous earth, DE）等过滤助剂直接加入进料中，形成多孔的不可压缩滤饼，作为过滤介质实现高效杂质去除，并防止过滤器堵塞，适用于约300 LMH的高通量。所需DE量取决于进料的生物湿重（biological wet mass, BWM）。此前仅有50 mL进料体积的小规模研究报道，本研究旨在开发一种稳健高效的澄清工艺，实现10–500 L中试规模高浊度进料的rAAV载体生产，并满足生物安全2级（对应风险组2）的全封闭操作要求。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统评估了十种不同材料和截留等级的深层过滤器或过滤器组合，发现即使性能最佳的深层过滤器，其单次使用胶囊的最大过滤面积也仅为0.027 m2，远不足以在全封闭系统中处理500 L中试规模的生产裂解物。作为替代方案，研究人员开发并优化了内部冲积过滤方法，确定最佳组合为PURAFIX? CH 31滤板、Celpure? C 300级DE以及DE:BWM比2:3。小规模对比实验表明，冲积过滤在容量上与最佳深层过滤器相当（约300 L/m2），但在产物回收率和杂质去除方面表现更优。放大计算显示，冲积过滤可通过单个胶囊提供所需过滤面积，而深层过滤器需要50个实验室规模单元或开放系统中的两个中试规模单元。实际放大实验在10 L、100 L和500 L三个规模下使用不同rAAV载体变体（rAAV2、rAAV8、rAAV9）进行，结果证实了方法的可放大性和稳健性，过滤容量分别为223 L/m2、256 L/m2和229 L/m2，产物回收率和浊度降低在各规模下均保持高水平。

三、关键技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：冲积过滤技术，将硅藻土（DE）以2:3的DE:BWM比例作为体进料直接加入裂解物中，通过PURACAP? SU或PURADISC? SU单次使用系统进行过滤；深层过滤技术，测试多种商用深层过滤器作为对照；生物湿重（BWM）测定，通过离心沉淀重量法计算所需DE添加量；放大计算方法，基于滤饼体积和过滤容量进行线性放大并考虑安全系数；浊度测量、定量聚合酶链反应（PCR）检测宿主细胞（HC）DNA、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测宿主细胞蛋白（HCP）以及液滴数字PCR和ELISA分别定量病毒基因组和完整衣壳。样本来自HEK293细胞三质粒转染生产的不同rAAV载体变体培养物。

四、研究结果

深层过滤器性能评估

研究人员在1–3 L进料体积、22–25 cm2过滤面积的小规模实验中测试了十种深层过滤器或组合，以容量为主要参数进行排序。结果显示各过滤器容量差异显著，范围为20至300 L/m2，而浊度降低值大多处于相似的高水平。性能最佳的三款过滤器中，两款为合成过滤器（Millistak+? HC Pro D0SP和C0SP，由聚丙烯酸纤维和二氧化硅组成），第三款含聚丙烯、纤维素和DE（Clarisolve? 20MS）。Millistak+? HC Pro D0SP以约300 L/m2的容量表现最佳，浊度降低>90%。然而，该过滤器在封闭胶囊中可用的最大过滤面积仅为0.027 m2，无法满足500 L中试规模全封闭处理所需的容量要求。

冲积过滤替代方案评估

研究人员开发了使用DE作为过滤助剂的内部冲积过滤方法，通过优化确定最佳组合为PURAFIX? CH 31滤板、Celpure? C 300 DE和2:3的DE:BWM比。小规模对比实验中，冲积过滤与最佳深层过滤器Millistak+? HC Pro D0SP的容量相当（约300 L/m2），过滤后绝对浊度值略高（63 NTU vs 40 NTU），但均处于适合后续无菌过滤的低范围。冲积过滤的推荐通量（480 LMH）显著高于深层过滤器（150 LMH）。在产物回收率方面，冲积过滤实现了病毒基因组95%和衣壳97%的回收率，HC DNA去除率100%，HCP去除率75%，浊度降低97%，各项指标均优于三款最佳深层过滤器。

冲积过滤与深层过滤的工艺差异比较

冲积过滤需要额外的准备步骤，包括测定BWM以确定DE添加量、将DE悬浮并加入裂解物中，增加了工艺复杂性和人工成本。但冲积过滤的通量和流速显著超过深层过滤，补偿了准备时间。对于500 L规模，计算显示深层过滤需约2小时，而冲积过滤仅需约30分钟。

放大考虑、可行性与封闭拆卸

针对500 L操作规模的计算表明，冲积过滤可通过单个胶囊提供所需的1.38 m2过滤面积，预期滤饼体积34 L远低于模块最大容量。而深层过滤需要50个实验室规模单元进行封闭处理，或两个中试规模单元采用开放过程的盒式方案。这一计算证明冲积过滤是唯一适合在全封闭系统中处理500 L中试规模的方法。

不同rAAV载体变体的关键操作规模

实际放大实验在10 L（3次生物反应器运行，rAAV2和rAAV9）、100 L（4次运行，rAAV2和rAAV8）和500 L（3次运行，rAAV2、rAAV8和rAAV9）规模下进行。过滤容量平均分别为223 L/m2、256 L/m2和229 L/m2，三个规模处于相同范围。产物回收率和浊度降低在各规模下保持高水平，无下降趋势，标准偏差在可接受范围内。HC DNA和HCP的杂质去除率偏差较大，但未显示随规模增大而效果下降的趋势。代表性500 L运行的压力和流速曲线显示，过滤前压力升至1.15 bar后几乎恒定，过滤后压力0.75 bar，流速仅从12 L/min微降至10 L/min，整个过滤时间约30分钟，与计算值吻合，且压力远低于1.5 bar限值，表明系统未达到最大过滤容量。

安全与风险缓解

中试规模过滤系统集成了硬件和软件解决方案，实现连续过程监测和反馈调节。系统完全使用单次使用泵、无菌接头和管道，并通过压力和流量传感器主动监测。当系统压力达到1.5 bar最大限值时，自动降低流速以防止超压。处理开始前检查所有连接，过滤器在预冲洗期间进行排气和压力测试以验证完整性，只有成功通过压力测试后才应用含病毒载体的工艺流体。

五、讨论部分总结

全封闭系统中的澄清可放大性是一大挑战。深层过滤器虽然有利于澄清且已建立单次使用技术，但单次使用胶囊过滤面积有限，无法满足中试规模全封闭操作。即使最佳性能的深层过滤器，其容量也远不足以处理500 L生物反应器规模。相比之下，冲积过滤通过单次使用柔性袋包装的滤板，可通过管焊接实现封闭插入和拆卸，且胶囊有多种尺寸可供选择，过滤面积和容量可随进料体积增加。

冲积过滤的性能已针对容量作为主要选择标准进行了全面优化。评估表明，滤板和DE等级越粗支持更高容量，而更细的材料改善杂质去除但容量较低。2:3的DE:BWM比相比供应商推荐的1:2增加了容量而不显著影响产物回收率和杂质去除，这与先前建议较低DE浓度的研究结果不同。该方法适用于不同rAAV载体变体，放大实验中产物回收率和浊度降低结果一致。HCP和HC DNA去除效率偏差较大，表明为优先实现高容量而做出的折衷，鉴于稳健的裂解物处理是关键目标，这一权衡可接受。

冲积过滤的总体性能在小规模评估中非常有前景，容量和过滤后浊度与最佳深层过滤器几乎相等，产物回收率和杂质去除更优。冲积过滤的缺点是准备复杂性和时间增加，但过滤本身时间比深层过滤缩短三倍以上，500 L规模可在30分钟内完成，准备时间得到充分补偿。

实际放大数据明确证实了方法的可放大性，500 L中试规模表现优异，系统未达到完全容量。压力保持在1.5 bar限值以下，滤饼体积低于最大可用体积，表明工艺对高浊度进料的稳健性。无菌过滤器在冲积过滤后的滤液中表现良好，无堵塞或产物损失，表明滤液适合后续纯化步骤。中试规模的执行确认了全封闭系统的安全操作和拆卸，完全符合德国基因技术法和工人安全法规的要求。

六、研究结论

在病毒载体生产培养物裂解物的澄清和收获中实施单次使用技术，是在全封闭系统中进行处理的至关重要的先决条件。这使得在缺乏独立拆卸空间的实验室中，能够符合所需安全标准并实现最高500 L生物反应器体积的中试生产规模的高效制造。本研究证明冲积过滤是一种合适的单次使用技术，能够在1至500 L的广泛进料体积范围内安全高效地处理含rAAV的培养裂解物。虽然深层过滤在行业内广泛使用，但本研究发现性能最佳的单次使用深层过滤技术无法提供足够的过滤面积（0.027 m2）来以确定的303 L/m2容量在全封闭方式下处理500 L生产裂解物。冲积过滤在优化条件下产生了类似的298 L/m2容量，但通过使用过滤面积高达2.71 m2的过滤模块，为全封闭中试规模处理提供了灵活性。此外，所提出的冲积过滤后接无菌过滤的方案在更快的操作速度和根据细胞培养裂解物的特定BWM调整过滤助剂量方面具有优势。为提高工艺安全性，实施了自动压力和泵速控制。所开发的方法增强了rAAV载体大规模生产的高效性和安全性，因此可能有助于满足基因治疗应用日益增长的需求。