靶向SNORA22的siRNA与叶酸偶联阳离子寡肽FA-Dab8α复合物：α-区域异构体优化递送并抑制胰腺导管腺癌生长

《Human Cell》：Inhibition of pancreatic cancer growth by an siRNA targeting SNORA22 and a folic acid-conjugated cationic oligopeptide

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）有效小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）治疗药物的开发受到限制其系统性稳定性的严峻生理屏障的严重阻碍。为应对这些关键挑战，研究人员开发了一种先进的主动靶向药物递送系统（drug delivery system, DDS），其利用叶酸偶联的l-2,4-二氨基丁酸八聚体（folic acid-conjugated l-2,4-diaminobutyric acid octamer, FA-Dab₈α）的新型区域异构体，与经策略性化学修饰的、靶向致癌性小核仁RNA SNORA22（small nucleolar RNA SNORA22）的siRNA复合。尽管SNORA22是抑制PDAC侵袭和转移的有力治疗靶点，但实现稳健的体内疗效需要高度优化的递送载体。在本研究中，研究人员系统评价了配体偶联的结构影响，证明α-区域异构体（FA-Dab₈α）可自发优化聚复合物包装，从而较其γ-对应物获得显著更优的细胞摄取、溶酶体转运和靶基因敲低。此外，策略性引入硫代磷酸酯键和2′-O-甲基修饰赋予优异的核糖核酸酶（RNase）抗性，维持血液中载荷稳定性。研究人员在采用人PDAC细胞系来源类器官建立的临床相关临床前小鼠模型中评价了该优化平台的治疗潜力。全身给予SNORA22 siRNA–FA–Dab₈α复合物导致24 h内显著的肿瘤蓄积，并诱导了前所未有的肿瘤生长抑制，显著优于临床标准化疗吉西他滨加紫杉醇（gemcitabine plus paclitaxel, GP）。组织病理学分析显示明显的肿瘤坏死和周围组织浸润大幅减少，且重要器官中未检测到全身毒性。这些发现表明，配体修饰寡肽载体的精确结构优化可实现高效寡核苷酸递送，确立SNORA22 siRNA–FA-Dab₈α复合物作为难治性胰腺癌强效且极具前景的临床策略。

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是主要癌症死亡原因，全球每年约250,000例死亡，预计2030年成为全球第二常见癌症。其预后差，1年和5年生存率仅20%和6%；约50–60%患者为转移或终末期，30–40%为局部不可切除，即使根治性手术后预后仍差。转移、终末期或术后复发患者的唯一治疗选择为姑息化疗，包括改良FOLFIRINOX（modified FOLFIRINOX, mFFX）或吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇（gemcitabine combined with albumin-bound paclitaxel, GnP）。GENERATE试验最终分析显示mFFX中位总生存14.0个月，不太可能超过GnP的17.1个月，因此GnP被推荐为远处转移和术后复发PDAC一线化疗。免疫检查点抑制剂和分子靶向治疗临床试验未显示预期疗效。因此，PDAC仍预后极差，迫切需要新的更有效治疗进入临床。RNA纳米技术利用合成siRNA递送新药，但siRNA高度阴离子，不易跨膜；需具备生物相容性、高载荷、运输保护和靶向能力的递送平台。siRNA无靶向功能，负电荷导致与细胞膜静电排斥而摄取差，故靶向递送系统需要癌细胞特异配体–受体对。叶酸（folic acid, FA）作为叶酸合成单谷氨酸形式，广泛用于癌症靶向配体偶联。研究人员此前使用FA修饰聚乙二醇–壳寡糖乳酸（PEG–COL）纳米颗粒递送siRNA，但制备复杂、耗时长且收率低。研究人员关注新型阳离子寡肽l-2,4-二氨基丁酸八聚体（Dab₈），其可结合并稳定siRNA；其质子化氨基距离与A型寡核苷酸双链大沟宽度对应。此前报道KH型剪接调节蛋白（KHSRP）及其靶snoRNA进入PDAC细胞RNA颗粒P-body，促进侵袭和转移；针对KHSRP结合snoRNA SNORA18和SNORA22的siRNA-FA-PEG-COL纳米颗粒在原位PDAC小鼠模型中抑制腹膜后区域侵袭和腹膜播散。本研究聚焦SNORA22，因其对腹膜后侵袭和肺转移作用最强。研究人员使用人PDAC细胞系S2-013，建立基于胰腺癌类器官培养的新型临床前小鼠模型，该模型产生的肿瘤异种移植接近人PDAC组织形态和结构，并用于研究PDAC肿瘤对FA-Dab₈结合的SNORA22 siRNA的特异摄取及抑瘤效果。

关键技术方法概述：研究人员采用Fmoc固相合成制备Dab₈、FA-Dab₈α和FA-Dab₈γ；合成靶向SNORA22、SNORA18及乱序对照siRNA并引入硫代磷酸酯和2′-O-甲基修饰。通过血清稳定性、电泳迁移率变动分析（EMSA）评价稳定性与结合；用共聚焦免疫荧光分析摄取、叶酸受体1（FOLR1）表达和溶酶体共定位；用半定量RT-PCR、Matrigel侵袭、MTT、Caspase 3/7、Ki-67、磷酸化蛋白阵列和western blot。样本来源：人PDAC细胞系S2-013、S2-CP8来自Tohoku University细胞资源中心；HPNE由University of Nebraska的Dr. Michael Hollingsworth提供；S2-013细胞系来源类器官由S2-013、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和间充质干细胞（MSC）建立；7周龄雌性BALB/cSlc-nu/nu裸鼠来自Japan SLC。采用S2-013类器官皮下异种移植模型，尾静脉注射，IVIS成像和H&E染色。

结果部分：

SNORA22 siRNA与FA-Dab₈复合物的制备：研究人员合成具有两个区域异构体FA-Dab₈α和FA-Dab₈γ的FA-Dab₈，用于靶向PDAC细胞的DDS；对SNORA22 siRNA进行化学修饰以增强血清稳定性，并制备SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α和SNORA22 siRNA-FA-Dab₈γ复合物。

SNORA22 siRNA的化学修饰以稳定其在血清中的稳定性：未修饰SNORA22 siRNA与血清混合后立即降解，即使存在FA-Dab₈α或FA-Dab₈γ；化学修饰类似物与血清混合后稳定达6 h且无降解。加入FA-Dab₈α或FA-Dab₈γ不能防止未修饰siRNA降解，而化学修饰赋予两种核酸类似物血清抗性。SNORA18结果相似。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈核酸化合物在PDAC和HPNE细胞中的摄取：用Alexa Fluor 647标记的化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α或γ处理S2-013细胞48 h，共聚焦显示S2-013对FA-Dab₈α的摄取大于FA-Dab₈γ，摄取α的细胞数显著更高。FOLR1在PDAC细胞系S2-013、S2-CP8和HPNE细胞膜表达，PDAC细胞显著高于HPNE；S2-013和S2-CP8胞质积累显著高于HPNE，荧光强度定量证实。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈核酸化合物通过内吞被PDAC细胞摄取：将Alexa Fluor 647标记的两种复合物加入S2-013细胞培养48 h，共聚焦显示S2-013摄取FA-Dab₈α多于FA-Dab₈γ；两种复合物均与Red DND-99标记的溶酶体共定位，提示经内吞内化，并通过内吞途径转运，这是siRNA载荷释放至胞质发挥RNA干扰效应所必需的初始步骤。

公共数据集中SNORA22的表达谱：RefEx数据库跨组织比较显示，正常人胰腺组织基础SNORA22表达低于检测限（0 TPM），表达仅限少数组织如大脑和肾上腺；TCGA数据集显示人PDAC组织标本中SNORA22持续表达。结合FOLR1在PDAC细胞相对正常胰腺上皮细胞显著过表达，这些转录组数据表明正常胰腺组织天然缺乏递送入口FOLR1和分子靶点SNORA22。与这些表达谱一致，正常胰腺上皮细胞表现出极小siRNA摄取且无靶点敲低。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈核酸化合物在PDAC细胞侵袭中的作用：MTT、Caspase 3/7和Ki-67实验显示，化学修饰SNORA22 siRNA与FA-Dab₈α复合物与对照组相比未显著改变细胞活力或凋亡率，Ki-67染色相似，表明SNORA22敲低主要抑制片状伪足介导的侵袭，而非直接影响细胞增殖或凋亡。磷酸化蛋白阵列显示SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α复合物显著降低p70^S6K磷酸化，后者是mTORC1通路下游效应子，对片状伪足形成关键；阵列还显示Src和RSK1/2磷酸化显著降低，MSK1/2和Akt1/2/3磷酸化增加。Western blot验证p70^S6K和Akt1/2/3，与阵列一致，化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α较SNORA22 siRNA–Dab₈明显降低p70^S6K磷酸化并增加Akt1/2/3磷酸化，确认mTORC1–Akt信号轴特异调节。半定量RT-PCR显示化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α显著降低S2-013细胞SNORA22表达，而γ未能抑制；定量分析显示α降低显著强于γ。靶向SNORA18时，α和γ均实现SNORA18敲低，α抑制作用更强。Matrigel侵袭实验显示，化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α降低S2-013侵袭显著强于乱序对照和SNORA22 siRNA-Dab₈，而γ的侵袭抑制效果与乱序对照和Dab₈相似；α显著强于γ。SNORA18实验中α抑制侵袭强于γ，但总体抑制弱于SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α。基于SNORA22靶点优越抑制，研究人员选择SNORA22进入后续小鼠模型药效评价。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈核酸化合物递送至S2-013类器官模型异种移植：EMSA分析化学修饰SNORA22 siRNA与FA-Dab₈α或γ在血清中的相互作用。尽管EMSA可能诱导核酸–蛋白复合物解离，血清中保留6 h的SNORA22 siRNA与FA-Dab₈α和FA-Dab₈γ的结合与无血清对照无显著差异。皮下植入S2-013来源类器官7周后，尾静脉注射Alexa Fluor 647标记的化学修饰SNORA22 siRNA-Dab₈、SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α和SNORA22 siRNA-FA-Dab₈γ，1、2、3当量，24 h后IVIS成像。化学修饰SNORA22 siRNA与2当量FA-Dab₈α的复合物及与3当量FA-Dab₈γ的复合物在异种移植中蓄积高于其他复合物。在无皮下S2-013类器官植入的小鼠中，2当量复合物主要经肾排泄，肝脏无荧光信号。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈复合物对S2-013类器官模型异种移植肿瘤生长的抑制作用：植入S2-013来源类器官1周后开始治疗，分组为乱序对照siRNA-FA-Dab₈α、化学修饰SNORA22 siRNA与2当量Dab₈复合物、化学修饰SNORA22 siRNA与2当量FA-Dab₈α复合物及GP。由于nab-紫杉醇是紫杉醇与人白蛋白组合，且担心小鼠对人白蛋白过敏，研究人员使用紫杉醇替代nab-紫杉醇。治疗9周后，化学修饰SNORA22 siRNA与2当量FA-Dab₈α复合物组肿瘤抑制显著大于其他组，包括GP组。GP疗效也优于乱序对照siRNA-FA-Dab₈α和化学修饰SNORA22 siRNA-Dab₈。化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α疗效高于GP。此外，化学修饰SNORA22 siRNA-Dab₈仅在FA存在时抑制肿瘤生长；无FA时，SNORA22 siRNA-Dab₈组与乱序对照siRNA-FA-Dab₈α组无显著差异。

SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α核酸化合物治疗后S2-013类器官模型异种移植的组织病理学评价：植入后9周（GP组）或10周（其他组）处死小鼠，制备异种移植切片并H&E染色。化学修饰SNORA22 siRNA与2当量FA-Dab₈α复合物治疗后肿瘤内坏死面积明显大于SNORA22 siRNA-Dab₈治疗；α治疗明显增加肿瘤坏死面积，且α组与GP组坏死面积有显著差异，α组坏死面积更大。所有治疗组异种移植均可见腺癌伴皮下组织区域侵袭；乱序对照siRNA-FA-Dab₈α、化学修饰SNORA22 siRNA-Dab₈和GP组可见相似浸润；α组较其他组减少皮下组织浸润。因此，化学修饰SNORA22 siRNA与2当量FA-Dab₈α复合物似乎通过两种机制抑制肿瘤生长：诱导肿瘤细胞坏死和抑制向周围皮下组织侵袭。补充宏观和低倍H&E评估显示，α复合物治疗肿瘤与周围正常组织边界清晰，而对照和GP治疗组呈高度浸润性肿瘤边缘和区域组织侵袭。给予乱序对照siRNA-FA-Dab₈α和化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α后，对肺、肝、肾上腺、肾等主要器官进行组织病理学检查，未见明显病理病变或结构异常；心脏和脾脏组织病理学也无异常发现。这些结果表明化合物耐受良好，未在这些重要器官中诱导可检测的组织损伤或细胞/结构水平毒性。

讨论部分总结：PDAC死亡率在日本和西方国家持续上升。2023年日本约44,000人诊断PDAC，近40,000人死亡，为第四大癌症死因；5年生存率仅5–10%，年死亡数接近诊断数，是最致命恶性肿瘤之一。治疗选择有限，迫切需要新有效治疗。PDAC瘤周环境对药物递送极具挑战，致密纤维化基质和高间质压是关键障碍。本研究首次成功证明使用新型DDS特异性靶向PDAC的核酸药物抗癌疗效，体外和体内结果均为阳性；该DDS克服PDAC药物递送重大障碍，提示该突破性方法未来可用于其他癌症。临床试验正在检验分子靶向和免疫检查点抑制剂，但当前疗效有限。PDAC癌症基因组分析常见KRAS、CDKN2A/p16、TP53和SMAD4/DPC4四基因突变。KRAS G12C抑制剂和pan-RAF抑制剂正在不可切除肺癌中评估，针对其他三个基因异常的药物仍在开发。PARP抑制剂olaparib对BRCA基因突变PDAC有效，已批准作为BRCA突变阳性不可切除PDAC在mFFX后的维持治疗；但仅约7% PDAC有BRCA突变，且限于维持治疗，适用性有限。研究人员旨在阐明PDAC细胞侵袭和转移机制。最初观察到侵袭细胞形成多个片状伪足，进而研究这些结构，鉴定参与PDAC细胞侵袭的关键信号通路和分子。为靶向这些分子，设计siRNA并开发由阳离子聚合物PEG和COL及FA组成的纳米颗粒DDS，FA受体在PDAC细胞膜高表达。在常规PDAC异种移植模型中，静脉给予靶向ARHGEF4、CCDC88A、LAMTOR2、mTOR、NUP85和WASF2的siRNA抑制直接腹膜侵袭并改善预后。进一步研究显示，包括SNORA22在内的snoRNA累积于片状伪足，对其形成和PDAC细胞侵袭贡献显著；同一异种移植模型中靶向SNORA22的siRNA抑制直接腹膜侵袭和远处转移并改善预后。核酸药物研发显著增长，近期遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性等难治性疾病药物获批。首个siRNA药物patisiran获美国FDA批准用于成人急性肝卟啉症；扩展研究确认长期安全性和疗效。美国、欧洲和日本至少已批准六种siRNA药物。Patisiran是敲低TTR mRNA的核酸药物，利用载脂蛋白E（ApoE）的脂质纳米粒作为DDS。但领域中七种获批siRNA药物中有六种包括givosiran采用配体偶联DDS，特别是GalNAc配体。这一成功凸显有效DDS尤其主动靶向对药物到达正确组织的重要性。在癌症药物发现中，核酸药物被高度期待为继抗体药物后的下一代疗法。尽管对包括PDAC在内的恶性肿瘤市场潜力巨大，全球进入临床试验者仍少。当前挑战包括确定相关RNA靶点，以及最重要的是开发有效DDS将药物递送至受累组织。其他获批核酸药物主动靶向的成功提示，这将是开发PDAC有效治疗的关键因素。为促进临床转化，研究人员开发适合临床使用的、靶向SNORA22的化学修饰寡核苷酸药物。此前报道通过PEG化增加分子量和调节电荷减少肾小球滤过排泄；在此基础上，研究人员利用FA-Dab₈替代阳离子聚合物纳米颗粒的改良DDS，生成靶向SNORA22的先导化合物。选择Dab₈因其八个氨基位置适合结合siRNA。为增强对高表达叶酸受体的PDAC细胞靶向，将FA偶联至Dab₈。为克服疏水脂双层屏障，亲水寡核苷酸与FA-Dab₈复合，通过结合PDAC细胞膜叶酸受体促进高效摄取。该靶向递送使化合物进入胞质并与SNORA22相互作用。FA-Dab₈ DDS能稳定SNORA22 siRNA并特异递送至PDAC组织。此外，为改善RNase抗性和血液稳定性，对先导化合物嘧啶碱基进行硫代磷酸酯和2′-O-甲基修饰优化。该化学修饰SNORA22 siRNA随后与FA-Dab₈ DDS偶联。尽管SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α和γ均成功转运至溶酶体，但α-区域异构体在PDAC细胞中显示显著更高的细胞摄取和更强功能敲低效力。靶向SNORA18实验也显示α修饰化合物功能效力更优，较γ对应物实现更强SNORA18敲低和更有效抑制细胞侵袭。这些发现尤其有趣，因历史数据存在冲突：一些研究报道γ羧基偶联对有效肿瘤摄取有效而α羧基无效，另一些认为α和γ偶联物结合亲和力和递送效率相似。基于人FOLR1–叶酸复合物晶体结构，叶酸谷氨酸部分暴露于溶剂，理论上允许在α或γ羧酸进行化学修饰而不破坏核心受体识别。因此，本研究中α偶联物的显著表型优越性可能源于所得聚复合物的宏观结构差异，而非配体单体本身内在受体结合亲和力。虽然这些聚复合物的详细生物物理表征如粒径分布和表面电荷仍是未来物理化学研究重要课题，但研究结果强调区域异构体选择是优化肽基递送系统的关键参数。公共数据库分析和体外评估显示，FA-Dab₈α递送系统实现稳健双层肿瘤选择性。第一，主动靶向递送受FOLR1细胞表面表达限制，FOLR1在人PDAC组织和细胞系持续过表达，而正常胰腺上皮细胞几乎缺失，确认FOLR1作为PDAC靶向治疗广泛适用“递送入口”。第二，致癌snoRNA靶点SNORA22在PDAC组织特异上调，而正常胰腺组织检测不到（RefEx中0 TPM）。因此，正常胰腺细胞因缺乏靶载荷摄取和内源SNORA22表达而天然防止非特异敲低或毒性。重要器官组织病理学检查显示全身给药后无可见结构损伤或毒性。尽管化合物主要经肾排泄，肾脏未见组织学异常。这些发现确认FA-Dab₈α递送平台在体内卓越安全性和高治疗潜力，完全由FOLR1表达和SNORA22靶点可用性提供的双层选择性支持。siRNA载体平台治疗效力高度依赖纳米结构特征，包括电荷分布、配体密度和分子包装，这些控制细胞摄取和内体逃逸。体内成像显示两个区域异构体的最佳复合比例不同，FA-Dab₈α需2当量，FA-Dab₈γ需3当量。这一差异强烈提示谷氨酸部分α位偶联改变Dab₈–siRNA复合物包装效率或空间重排，可能自发优化纳米结构上叶酸配体空间取向和表面密度，促进受体介导内吞和后续内体/溶酶体逃逸。详细结构分析仍是未来目标，但结果强调区域异构体选择在寡核苷酸递送系统优化中的关键影响。为确定靶向SNORA22的化学修饰寡核苷酸药物是否抑制肿瘤生长和PDAC组织向周围组织浸润，研究人员进行体内实验。肿瘤学中许多候选药物未能实现概念验证，阻碍进入临床试验；因此使用相关模型的临床前研究对建立概念验证至关重要。常规PDAC异种移植模型常缺乏临床疗效预测力，需要更接近临床PDAC的小鼠模型。PDAC中肿瘤微环境包括癌基质对疾病进展关键。PDAC细胞向周围组织浸润常依赖基质相互作用，需要在包含该关键组分的模型中评估药物抗浸润效力。S2-013类器官模型符合这些标准，是预测药物疗效的有前景工具。研究人员近期在S2-013类器官模型中证明，mTOR蛋白激酶选择性抑制剂rapamycin的肿瘤生长抑制效应并非抑制细胞增殖，而主要抑制肿瘤侵袭；这强调mTOR信号驱动PDAC侵袭的核心作用。本研究中，化学修饰SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α复合物经尾静脉静脉给予S2-013类器官模型；给药后24 h荧光成像确认药物在异种移植PDAC组织内蓄积。该药物显著抑制肿瘤生长和侵袭，提示其能抑制PDAC从原发肿瘤向周围组织扩散，并可能代表首个具此疗效的核酸药物。为阐明SNORA22抑制影响的特定信号级联，研究人员进行磷酸化蛋白阵列分析。关键的是，该检测发现靶向SNORA22的核酸药物抑制mTOR信号下游效应子，与先前rapamycin观察到的侵袭抑制表型一致。SNORA22 siRNA-FA-Dab₈α复合物处理减弱mTOR信号网络中多个下游效应子和介质的磷酸化，尤其p70^S6K、Src和RSK1/2磷酸化显著降低，MSK1/2和Akt1/2/3磷酸化增加。抑制p70^S6K后Akt磷酸化同时升高，是胰岛素受体底物-1（IRS-1）介导负反馈环路解除的已知生化现象。此外，Carracedo等证明mTORC1抑制同时通过类似PI3K依赖反馈环导致MAPK通路代偿激活。鉴于MSK1/2是MAPK级联直接下游效应子，本研究中MSK1/2磷酸化增加与该既定反馈机制完全一致。连接非编码SNORA22与mTOR/p70^S6K激酶级联的精确生化介质仍有待未来研究定位，但这些数据表明靶向SNORA22有效破坏多个同时存在的促侵袭信号通路，最终抑制片状伪足介导侵袭。本研究的局限是依赖单一靶向SNORA22的siRNA序列，这在靶细胞内固有存在序列依赖脱靶效应风险。虽然FOLR1靶向FA-Dab₈α递送系统有效减少天然缺乏FOLR1和SNORA22的正常组织中非特异载荷积累和全身毒性，但验证胞内序列特异性仍重要。因此，未来临床前研究将使用多个独立靶向SNORA22不同区域的siRNA序列，结合严格in silico同源谱分析，全面验证这些表型发现，以在临床转化前明确排除脱靶干扰。

研究结论翻译：总之，S2-013类器官模型显示，靶向SNORA22的化学修饰寡核苷酸药物显著改善治疗效果，表明该单药具有用于人类治疗的潜力。在非临床动物安全性研究前，研究人员将进行in silico分析，预测靶向SNORA22的siRNA与非预期靶标杂交所致潜在脱靶毒性，因为靶向SNORA22的siRNA序列是活性药物成分。研究人员还将分析SNORA22在小鼠、大鼠、狗、食蟹猴和猪等多种动物中的表达，以选择合适种属用于非临床研究。这些结果将指导最终非临床研究计划，以研究靶向SNORA22的化学修饰寡核苷酸药物的安全性。