基于分子诊断与16S rRNA测序的商品猪场临床病猪病原检测及微生物群落特征分析

《Frontiers in Veterinary Science》：Pathogen detection and microbial community characterization in clinically symptomatic pigs from commercial farms

有效控制猪病需要对主要病原体进行持续监测，并在疾病条件下全面了解微生物群落动态。本研究从韩国商品猪场的临床病猪中收集了肺、口腔液和粪便样本。研究人员针对主要呼吸道和肠道病原体进行了分子诊断（多重qPCR/RT-qPCR），以评估感染状况，同时利用16S rRNA基因测序同步表征呼吸道和肠道微生物群。大多数呼吸道病原体在口腔液中的检出率高于肺样本。在所有病原体中，多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）的总体检出频率最高，而猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在肺样本中检出率最高。在肠道病原体中，轮状病毒（rotavirus）的检出率最高。微生物组分析显示，肺样本的物种多样性最低，而肺、口腔液和粪便样本之间的微生物群落结构存在显著差异。普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相关的属在粪便样本中占优势。肺微生物群的特征是以少数分类单元为主，包括埃希氏菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）和放线杆菌（Actinobacillus），而口腔液则表现出更均匀的微生物组成，富含莫拉菌（Moraxella）和链球菌（Streptococcus）。在产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）阳性组和阴性组之间，鉴定出了差异丰度的分类单元和对比性的预测功能谱，表明产气荚膜梭菌的存在与肠道微生物群落组成之间存在潜在关联。本研究将现场条件下临床患病猪的分子诊断与微生物组分析相结合。这些发现为养猪生产系统中基于微生物组的监测以及对病原体相关变化的解读提供了现场证据。

研究背景与目的

全球范围内，猪只受到多种病毒性和细菌性疾病的影响，导致生长速率下降、死亡率升高、治疗成本增加、抗生素用量增大，给养猪业造成重大经济损失。呼吸道疾病常由猪圆环病毒（PCV2、PCV3）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等原发性感染启动，继发多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）等细菌感染，最终形成猪呼吸道疾病综合征（PRDC）。肠道疾病则主要与致病性大肠杆菌（Escherichia coli）、轮状病毒（rotavirus）和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）有关。集约化养殖系统加剧了病原体的快速传播。因此，早期快速准确的病原检测对于有效控制疾病至关重要。然而，疾病的发病和进展不仅受单个病原体影响，还受多种微生物间的复杂相互作用调控。微生物群在调节宿主免疫反应和影响病原体定植方面起着关键作用。因此，对疾病状态的理解需要综合考虑病原体存在和微生物群落结构。但目前，在商业化养殖条件下，同时调查临床患病猪的病原检测和微生物组构成的研究仍然稀缺。

研究内容与结论

为填补这一空白，研究人员从韩国商品猪场的临床病猪中收集了下呼吸道（肺）、上呼吸道（口腔液）和肠道（粪便）样本。通过多重实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和一步法反转录qPCR（RT-qPCR）检测主要猪病原体以评估感染状态，同时利用高通量16S rRNA基因测序比较不同样本类型的微生物群，并整合分子诊断结果与微生物群落数据，探索病原体存在与微生物群落结构之间的潜在关联。

研究得出以下重要结论：第一，多数呼吸道病原体在口腔液中的检出率高于肺样本，其中多杀性巴氏杆菌在口腔液中检出率最高（76.1%），而PRRSV在肺样本中检出率最高（60.6%）；在肠道病原体中，轮状病毒在粪便中检出率最高（43.0%）。第二，微生物组分析揭示，肺样本的物种多样性（Chao1和Shannon指数）显著低于口腔液和粪便样本，而口腔液与粪便样本间无显著差异。β多样性分析显示三类样本的微生物群落结构显著分离，其中粪便样本与呼吸道样本区分最为明显。第三，肺微生物群以埃希氏菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）（18.11%）和放线杆菌（Actinobacillus）（14.45%）等少数类群为主导；口腔液则呈现更均匀的分布，富含莫拉菌（Moraxella）（5.86%）和链球菌（Streptococcus）（5.80%）。线性判别分析效应大小（LEfSe）进一步确认了区分肺与口腔液的标志性类群。第四，在按病原体检测状态分组的分析中，产气荚膜梭菌（C. perfringens）显示出最显著的微生物多样性和群落组成差异。其阳性组中拟杆菌（Bacteroides）和梭杆菌（Fusobacterium）相对富集，而阴性组中普雷沃氏菌（Prevotella）和普雷沃氏菌科NK3B31群（Prevotellaceae_NK3B31_group）丰度更高。基于PICRUSt2的功能预测也揭示了两组间代谢潜能的对比。敏感性分析证实，在校正农场聚类效应后，与产气荚膜梭菌相关的差异依然稳健。

关键技术方法

1. 1.
   样本采集：从韩国34至21个不等的商品猪场收集临床病猪的肺（n=33）、口腔液（n=67）和粪便（n=79）样本，提交至经韩国动植物检疫局（APQA）认可的兽医诊断实验室（Postbio Inc.）。
2. 2.
   分子诊断：采用多重qPCR/RT-qPCR技术定性检测样本中的主要呼吸道病原体（PRRSV、PCV2、PCV3、A. pleuropneumoniae、P. multocida）和肠道病原体（轮状病毒、致病性E. coli、C. perfringens），Ct值<35判定为阳性。
3. 3.
   16S rRNA基因测序与生物信息学分析：扩增V4区域，在Illumina MiSeq平台测序。使用QIIME 2和DADA2流程处理数据，基于SILVA 138数据库进行物种注释。利用R、MicrobiomeAnalyst和STAMP软件进行α多样性（Chao1、Shannon）、β多样性（Bray-Curtis距离、PCoA、PERMANOVA）、LEfSe差异丰度分析及PICRUSt2功能预测。

研究结果

3.1 肺、口腔液和粪便样本中的病原体检出与共现

研究人员通过多重qPCR/RT-qPCR检测发现，不同样本类型中病原体检出率各异。在肺样本中，PRRSV检出率最高（60.6%），其次为PCV2（39.4%）、P. multocida（18.2%）、PCV3（15.2%）和A. pleuropneumoniae（6.1%）。在口腔液中，P. multocida检出率最高（76.1%），其次为PRRSV（53.7%）、PCV3（47.8%）、PCV2（43.3%）和A. pleuropneumoniae（32.8%）。在粪便中，轮状病毒检出率最高（43.0%），其次为C. perfringens（30.4%）和致病性E. coli（25.3%）。所有样本类型内均未观察到病原体间具有统计学意义的共现关系。

3.2 肺、口腔液和粪便样本间微生物群的比较

α多样性分析显示，肺样本的Chao1和Shannon指数显著低于口腔液和粪便样本（p<0.001），而后两者间无显著差异。β多样性PCoA图显示三类样本形成三个显著分离的簇（PERMANOVA，p=0.001），其中口腔液与肺部分重叠，而粪便完全分离。在门水平，粪便以厚壁菌门（Firmicutes，40.63%）和拟杆菌门（Bacteroidota，42.97%）为主；呼吸道样本中变形菌门（Proteobacteria）相对丰富。在科水平，普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）在粪便中占优（31.26%）。在属水平，肺样本以Escherichia-Shigella（18.11%）、Actinobacillus（14.45%）和支原体（Mycoplasma，7.05%）为主导；口腔液则分布更均匀，以Prevotella（6.47%）、Moraxella（5.86%）和Streptococcus（5.80%）为主。LEfSe分析鉴定出8个区分肺与口腔液的标志性类群：肺中富集Escherichia-Shigella、魏斯氏菌（Weissella）和耶尔森氏菌科（Yersiniaceae）；口腔液中富集Moraxella、Streptococcus、Clostridium_sensu_stricto_1、韦荣氏球菌（Veillonella）和伯杰氏菌（Bergeyella）。

3.3 与病原体状态相关的微生物群落差异

研究人员根据病原体检测状态分组分析微生物群落差异。在α多样性方面，C. perfringens阴性组Chao1指数显著高于阳性组，表明物种丰富度更高。PCV2、PCV3和P. multocida阳性组也显示出更高的物种丰富度。在β多样性方面，C. perfringens阳性与阴性组间微生物群落结构存在显著差异（PERMANOVA，p<0.05），且PERMDISP检验不显著，确认差异并非由组内离散度驱动。LEfSe分析识别出Bacteroides、Fusobacterium、Prevotella和Prevotellaceae_NK3B31_group为关键区分性类群。此外，PRRSV、PCV2和轮状病毒的阳性与阴性组间也观察到β多样性显著差异，但PRRSV和PCV2的PERMDISP检验显著，提示结果可能受组内变异影响。PICRUSt2功能预测显示，C. perfringens阳性组中涉及营养获取、环境应激适应和微生物间竞争的途径（如ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统PTS）预测丰度更高；阴性组中涉及转录和氨基酸生物合成（如RNA聚合酶、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成）的途径预测丰度更高。敏感性分析证实，只有与C. perfringens相关的差异在校正农场聚类效应后仍保持显著。

讨论与结论

本研究表明，在商业化猪场中，大多数呼吸道病原体在口腔液中的检出率高于肺样本，这反映了口腔液作为群体样本的特性以及上呼吸道的无症状携带现象。PRRSV在肺和口腔液中均有高检出率，可能反映了个体和群体水平的持续或既往感染。轮状病毒在肠道病原体中检出率最高，其具有人畜共患潜力，强调了持续监测的重要性。

微生物群分析揭示了肺、口腔液和粪便样本间截然不同的群落结构。口腔液的物种多样性与粪便相当，表明其是一个高微生物多样性的基质。肺微生物群的低多样性和特定类群（如Escherichia-Shigella）的优势需谨慎解读，可能源于低生物量样本的污染或携带。口腔液因接触鼻腔、扁桃体和口咽等多个生态位，富集了来自这些部位的标志性类群。

在病原体关联分析中，C. perfringens是唯一一个与微生物多样性和群落组成显示出稳健关联的病原体。其阳性组中Fusobacterium和Bacteroides的富集，以及阴性组中Prevotella的富集，与人类肠道疾病中观察到的模式相似，暗示了潜在的肠道微生态失调。功能预测的差异进一步支持了这一观点。

研究结论：本研究从自然发病的商业猪场获得了诊断和微生物组数据。结果显示，大多数呼吸道病原体在口腔液中的检出率高于肺样本，其中PRRSV在肺中、P. multocida在口腔液中、轮状病毒在粪便中检出率最高。微生物群分析显示三类样本具有独特的群落结构。特别是，根据C. perfringens的检测状态，观察到肠道微生物群落组成和预测功能谱的差异，指出了病原体检出与微生物群落组成之间的可能关联。这些现场观察可为未来纳入更全面元数据的研究提供参考。