活动性内脏利什曼病中 IFN-gamma 相关炎症状态的转录组证据：与儿童 HLH 的探索性跨区室比较

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Transcriptomic evidence of an IFN-gamma-associated inflammatory state in active visceral leishmaniasis: an exploratory comparison with pediatric HLH

背景：内脏利什曼病（visceral leishmaniasis, VL）可进展为继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH），但活动性 VL 与儿童 HLH 之间的转录组相似性仍不确定。方法：研究人员整合了 VL 全血表达数据（GSE125992）、儿童 HLH 与严重脓毒症中分选 CD68 阳性单核细胞的 bulk 表达数据（GSE150707），以及支持性利什曼原虫感染小鼠脾脏单细胞数据（GSE240385）。评估了差异表达、通路富集、探索性 132 基因 HLH 对脓毒症衍生 ssGSEA（single-sample gene set enrichment analysis）评分、FARDEEP-LM22 解卷积、排除特征基因的 WGCNA（weighted gene co-expression network analysis）、CellChat 和重新拟合的三基因分类器。结果：活动性 VL 显示 IFN-gamma 相关表达变化，包括 CXCL9 和 CXCL10 升高。探索性 132 基因评分在 ActiveCase 中高于 EHC（endemic healthy control）样本（Mann-Whitney P = 0.000637）。在 22 个解卷积细胞类型中，仅 M1 巨噬细胞显示与该评分呈 FDR（false discovery rate）支持的正相关（rho = 0.787，BH q = 0.000503）。在网络构建前排除全部 132 个评分基因后，一个 124 基因 magenta 模块仍与该评分相关（rho = 0.837，BH q = 4.29 × 10^-5）。重新拟合的 IFNG/GBP5/MX2 分类器获得同研究验证 AUC（area under the curve）为 0.917（bootstrap 95% CI 0.733-1.000），但验证集仅含 16 个样本。结论：这些公共数据集支持活动性 VL 中 IFN-gamma 相关炎症状态以及与儿童 HLH 的探索性跨区室汇聚。132 基因评分、解卷积、网络和分类器结果为假设生成性，不能确立 HLH 特异性、细胞因果性、独立外部效度或临床 HLH 预测。

噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH）是快速进展的高死亡率高炎症综合征，其核心病理基础为免疫系统持续失控放大和细胞因子风暴形成。近期研究提示，单核细胞和巨噬细胞异常激活、CD8⁺ T 细胞和自然杀伤细胞（natural killer, NK）持续释放 IFN-gamma，以及以 STAT1 为中心的炎症转录程序过度激活，共同驱动 HLH 病理进展。尤其 IFN-gamma 介导的趋化因子放大轴，如 CXCL9/CXCL10，被视为连接细胞毒性淋巴细胞活性与髓系炎症放大的关键桥梁，并与疾病严重程度密切相关。感染相关继发性 HLH 在儿童中占显著比例，提示病原诱导的免疫失调与 HLH 发生相关。内脏利什曼病（visceral leishmaniasis, VL）由利什曼原虫感染引起，以长期累及单核-巨噬细胞系统和复杂免疫激活与抑制为特征，部分儿童 VL 患者可发生继发性 HLH，临床风险增加。然而，VL 相关 HLH 研究仍较碎片化，缺少经临床表征的 VL 伴或不伴 HLH 患者分子数据集，也未建立 VL 全血与儿童 HLH 单核细胞在考虑区室和细胞组成差异后是否存在可重复转录状态。探索性评分可总结跨数据集相似性，但不能替代临床 HLH 表型或证明共享机制。因此，研究人员结合 VL 宿主转录组发现、儿童 HLH 分选 CD68 阳性单核细胞探索性特征、支持性小鼠单细胞背景、排除特征基因的共表达分析，以及分类器开发和同研究实验级验证，以探索活动性 VL 与儿童 HLH 之间的转录组关联。

关键技术方法不超过 250 字：研究人员使用公共 GEO（Gene Expression Omnibus）数据集，包括 GSE125992（活动性 VL 与 EHC 全血微阵列）、GSE150707（儿童 HLH n = 12 与严重脓毒症 n = 8 的分选 CD68 阳性单核细胞 bulk 表达）、GSE240385（利什曼原虫感染小鼠脾脏和骨髓单细胞，仅脾脏 n = 2 用于支持性背景）、GSE125991（同研究实验级验证，ActiveCase n = 10，EHC n = 6）。主要方法为 limma 差异表达、GO-BP/KEGG/Reactome 过代表分析、预排序 GSEA、探索性 132 基因 HLH 对脓毒症衍生 ssGSEA 评分、FARDEEP-LM22 解卷积、排除全部 132 个评分基因后的 WGCNA、CellChat 细胞通信推断，以及 LASSO 重新拟合 IFNG/GBP5/MX2 分类器和 ROC 与校准分析。

差异表达与通路富集特征在活动性 VL 中：对 GSE125992 全部 21 个 exp2 样本（ActiveCase n = 11；EHC n = 10）进行差异表达分析，显示组间广泛转录组差异。ActiveCase 中 CXCL9、GBP5、CXCL10、GBP1 和 STAT1 表达较高，CD163、HMOX1、S100A8 和 S100A9 表达较低。在 log₂FC > 1 且 BH q < 0.05 时，268 个基因上调；在 log₂FC < -1 且 BH q < 0.05 时，370 个基因下调。GO-BP、KEGG 和 Reactome 过代表分析以细胞分裂、有丝分裂纺锤体、染色体分离、DNA 修复、DNA 复制和细胞周期通路为主。预设 GSEA 显示 Reactome 干扰素信号正富集（NES = 1.720，BH q = 0.0140），Reactome 干扰素 gamma 信号未达 FDR 阈值（NES = 1.238，BH q = 0.209），KEGG 细胞因子-细胞因子受体相互作用呈负富集（NES = -1.622，BH q = 0.0133）。该分析支持活动性 VL 存在显著增殖或细胞周期相关表达及选择性 IFN 相关信号，但不能证明巨噬细胞高反应性或因果 IFN-gamma 机制。

儿童 HLH CD68 阳性单核细胞中的探索性差异表达与通路特征：对 GSE150707 分选 CD68 阳性单核细胞 bulk 表达队列进行样本级分析，比较儿童 HLH（n = 12）与严重脓毒症（n = 8）。无基因同时满足 |log₂FC| > 1 和全局 BH q < 0.05。以 |log₂FC| > 1 且名义 P < 0.05 进行探索性可视化，得到 212 个上调和 62 个下调基因。GO-BP 和 KEGG 过代表分析提示金属离子反应、II 型干扰素反应、抗病毒防御、抗原加工和提呈以及 NOD 样受体信号。预排序 Reactome GSEA 识别干扰素 gamma 信号（NES = 2.736，BH q = 0.0151）。映射至 GSE125992 后，212 个探索性基因中有 132 个代表基因用于探索性评分；该评分未作为 FDR 确认或 HLH 特异性特征。

活动性 VL 中的探索性 132 基因 HLH 对脓毒症衍生评分：为评估跨区室转录相似性，将 212 个探索性 GSE150707 HLH 对脓毒症上调基因中的 132 个映射至 GSE125992，并以秩归一化 ssGSEA 汇总。全 21 个样本表达矩阵 PCA 显示 ActiveCase 与 EHC 部分分离。探索性 132 基因评分在 ActiveCase 中高于 EHC（中位差 = 0.377；Mann-Whitney P = 0.000637；rank-biserial correlation = 0.891；bootstrap 95% CI 中位差 0.194-0.632）。由于该评分源自名义 P 选择的儿童 HLH 对脓毒症对比并投射到 VL 全血，该发现仅提示跨区室转录汇聚，不建立 HLH 特异性、临床 HLH 或因果炎症机制。

活动性 VL 全血与儿童 HLH 单核细胞的探索性跨数据集交集：将 268 个严格 GSE125992 VL 上调基因与 212 个探索性 GSE150707 HLH 上调基因取交集，经基因 ID 协调后获得 14 个重叠基因、254 个 VL 独有基因和 198 个 HLH 独有基因。对 14 基因探索性交集，以两注释数据集共享的 13,554 个基因为背景进行 Reactome、GO-BP 和 KEGG 富集。Reactome 结果包括金属硫蛋白或金属反应、GBP 介导宿主防御和干扰素 gamma 信号；GO-BP 结果包括金属离子反应、II 型干扰素反应和抗病毒防御。KEGG 中矿物质吸收（BH q = 2.54 × 10^-5）和 NOD 样受体信号（BH q = 0.00157）达到 BH q < 0.05。这些通路结果为探索性，不能消除跨平台、细胞组成或样本区室混杂。

IFN-gamma 相关基因在两个数据集中的表达和相关性模式：在 GSE125992 全部 21 个 exp2 样本中，STAT1 在 ActiveCase 中略高于 EHC（log₂FC = 0.290，名义 P = 0.0298），但全转录组 BH 校正后不显著（q = 0.116）。CXCL9（log₂FC = 1.504，名义 P = 6.08 × 10^-5，BH q = 0.00129）和 CXCL10（log₂FC = 1.957，名义 P = 1.39 × 10^-4，BH q = 0.00244）在 ActiveCase 中较高，并在 BH 校正后保持显著。在 GSE150707 中，HLH 对严重脓毒症比较显示 STAT1 名义 P = 0.00599、BH q = 0.884，CXCL9 名义 P = 0.0558、BH q = 1.000，CXCL10 名义 P = 0.0343、BH q = 1.000，均未在全局 BH 校正后显著。在 GSE125992 全部 21 个样本中，Spearman 分析评估 IFNG、STAT1、CXCL9、CXCL10 和 FCGR1A 共表达，并对 10 对相关性作 BH 校正；探索性 132 基因评分与 CXCL9（rho = 0.809，原始 P = 8.96 × 10^-6，BH q = 2.14 × 10^-5）和 IFNG（rho = 0.655，原始 P = 0.00128，BH q = 0.00128）相关。这些队列内关联支持活动性 VL 中 IFN-gamma 相关转录，但不证明 VL 全血与儿童 HLH 单核细胞之间机制相同或存在因果关系。

活动性 VL 中细胞毒性效应相关表达模式：在 GSE125992 全部 21 个 exp2 样本中评估 GZMB、PRF1 和 FASLG，limma 分析显示每个基因在 ActiveCase 中较高：GZMB（log₂FC = 0.761，名义 P = 0.00152，BH q = 0.0141）、PRF1（log₂FC = 0.775，名义 P = 2.72 × 10^-4，BH q = 0.00402）、FASLG（log₂FC = 1.475，名义 P = 5.05 × 10^-6，BH q = 2.14 × 10^-4）。这些表达差异提示细胞毒性效应相关转录活性，但不直接测量细胞毒性功能。Spearman 相关矩阵显示 GZMB、PRF1、FASLG 和 IFNG 共表达，在六对相关性中五对保留 BH q < 0.05，而 GZMB-PRF1 未保留（rho = 0.420，BH q = 0.0584）。探索性 132 基因评分与 FASLG（rho = 0.805，原始 P = 1.07 × 10^-5，BH q = 2.14 × 10^-5）和 PRF1（rho = 0.790，原始 P = 2.08 × 10^-5，BH q = 2.77 × 10^-5）相关。这些关联为横断面，不证明失控细胞毒性功能或致病性 HLH 机制。

FARDEEP-LM22 免疫细胞解卷积及相关性分析：对 GSE125992 全部 21 个 exp2 外周血样本（ActiveCase n = 11；EHC n = 10）应用 FARDEEP-LM22，所有样本解卷积 P < 0.05。经四个预设组比较的 BH 校正后，ActiveCase 样本单核细胞分数低于 EHC（BH q = 0.0171），M1 巨噬细胞分数高于 EHC（BH q = 0.0171）。CD8⁺ T 细胞（BH q = 0.188）和活化 NK 细胞（BH q = 0.0621）分数未达 FDR 阈值。在 21 样本分析中，探索性 132 基因评分与全部 22 个 LM22 细胞类型作 Spearman 相关，并在完整 22 项检验族中作 BH 校正，仅 M1 巨噬细胞保留 FDR 支持（rho = 0.787，原始 P = 2.29 × 10^-5，BH q = 0.000503；bootstrap 95% CI 0.626-0.847）。CD8⁺ T 细胞、静息 NK 细胞和活化 NK 细胞关联未获 FDR 支持。静息肥大细胞和静息树突状细胞分数恒为零，其相关性不可估计，并以 P = 1、q = 1 保守保留。

支持性小鼠单细胞背景和 CellChat 推断通信：GSE240385 仅提供支持性小鼠脾脏单细胞背景。质控和聚类后识别 15 个主要细胞亚群，两个感染脾脏样本显示总体相似的细胞类型组成。Stat1、Cxcl9、Cxcl10、Isg15 和 Gbp2 的 FeaturePlot 分布及相应细胞类型 DotPlot 见补充材料。由于该数据集缺少未感染对照且仅含两个脾脏样本，这些观察不构成对人类全血或分选单核细胞发现的验证。CellChat 推断 CD8⁺ T 细胞、NK 细胞和 T 细胞向巨噬细胞或单核细胞的 IFNG-IFNGR1/IFNGR2 通信，以及巨噬细胞向 CD8⁺ T 细胞、NK 细胞和 T 细胞的 CXCL9/CXCL10-CXCR3 通信。这些基于转录本的通信概率为支持性关联，不证明细胞因子分泌、受体激活或因果细胞间信号。HMOX1 敏感性分析显示，HMOX1 与排除 HMOX1 的血红素代谢评分不显著相关（rho = -0.229，双侧 P = 0.319，bootstrap 95% CI -0.668 至 0.243），与排除 HMOX1 的炎症反应评分不显著相关（rho = 0.369，P = 0.0999，95% CI -0.092 至 0.747），调整血红素代谢评分后的残差关联也不显著（rho = 0.294，P = 0.197，95% CI -0.195 至 0.692）。

排除特征基因的 WGCNA 识别活动性 VL 中与评分相关的共表达模块：为处理评分基因直接环状问题，在排除全部 132 个评分基因后，于 GSE125992 全部 21 个 exp2 样本中重新进行 WGCNA。在 power 1-20 中，无一达到 signed scale-free topology R2 >= 0.80，因此使用预设小样本回退 power 16。将 5,000 个最高 MAD 的非特征基因分配至模块。14 个模块与 ActiveCase 状态、探索性 132 基因评分、估计 M1 巨噬细胞分数和估计 CD8⁺ T 细胞分数相关，并对全部 56 个模块-性状检验作 BH 校正。124 基因 magenta 模块显示最强评分关联（rho = 0.837，原始 P = 2.30 × 10^-6，BH q = 4.29 × 10^-5），也与 ActiveCase 状态相关（rho = 0.651，BH q = 0.0130）。其与 M1 巨噬细胞（rho = 0.382，BH q = 0.275）和 CD8⁺ T 细胞（rho = -0.530，BH q = 0.0757）的关联未获 FDR 支持。在 magenta 模块内，绝对模块成员度与探索性评分基因显著性相关（rho = 0.778，P = 2.05 × 10^-26）。高绝对模块成员度前 30 个基因网络突出 ASPHD2、LGALS3BP、C1QB、GRAMD1B、BATF2、IL15RA、C2 和 C1QC。探索性 GO-BP 分析包括 II 型干扰素反应、细胞因子反应和宿主防御，但无条目达到 BH q < 0.05（最小 BH q = 0.202）。排除特征网络支持相关转录模块，而非通路水平 FDR 显著性获因果机制。

IFNG/GBP5/MX2 活动性 VL 炎症分类器开发和同研究验证：固定 GSE125992 分析选择 lambda.min = 0.02878664，并保留 IFNG、GBP5 和 MX2 的非零系数。冻结方程为 logit(p) = -18.7752806 + 0.7503904 × IFNG + 2.2059416 × GBP5 - 1.1916386 × MX2。训练预测概率在 ActiveCase 与 EHC 样本间不同（Wilcoxon P = 5.67e-06），表观训练 AUC 为 1.000（bootstrap 95% CI 1.000-1.000）。重新拟合并完全指定的模型在应用至 GSE125991 前冻结，未进行验证集特征选择、系数重新拟合或阈值优化。GSE125991 中验证 AUC 为 0.917（bootstrap 95% CI 0.733-1.000）；在预设阈值 0.5 时，敏感度为 0.900，特异度为 0.833。探索性校准显示 Brier 分数为 0.130，校准斜率为 1.231，因验证队列仅含 16 个样本，bootstrap 不确定性较宽。GSE125991 与 GSE125992 属于同一 SuperSeries 中的实验，不能排除参与者水平重叠；该分析为同研究实验级验证，而非独立外部验证，不建立临床 HLH 预测。

讨论部分总结：活动性 VL 全血数据集显示 IFN 相关、趋化因子、抗原提呈和髓系相关转录变化，与既往 VL 转录组研究一致。CXCL9 和 CXCL10 在全转录组校正后较高，而 STAT1 差异较温和。这些观察支持活动性 VL 中 IFN-gamma 相关炎症状态，但公共数据未证明 IFN-gamma 驱动因果环路。儿童 HLH 与严重脓毒症分选 CD68 阳性单核细胞比较提供探索性对照，而非匹配验证队列；132 基因评分源自名义 P 选择对比，在活动性 VL 中较高，但可能捕获更广泛 IFN 相关炎症反应，而非 HLH 特异生物学。ssGSEA 跨平台投影减少直接数据合并需求，但未消除年龄、区室、细胞组成、平台或疾病背景混杂。IFN-gamma/STAT1/CXCL9-CXCL10 轴因此被解释为 VL 中候选关联网络及与儿童 HLH 的探索性汇聚点。基因表达、评分、解卷积、WGCNA 和 CellChat 发现互相提供背景，但仍为观察性和计算性。FARDEEP-LM22 识别 M1 巨噬细胞-评分关联的 FDR 支持，但未支持 CD8⁺ T 细胞、静息或活化 NK 细胞关联。在重新 WGCNA 前排除全部 132 个评分基因去除了直接基因成员环状，所得 magenta 模块仍与评分相关，但共享上游生物学和横断面混杂仍可能存在。CellChat 和相关性分析不能证明细胞因子分泌、通路激活或因果信号。HMOX1 表达可能反映红细胞吞噬、血红素负荷、溶血或氧化应激、巨噬细胞激活或这些过程混合；在全部 21 样本敏感性分析中，HMOX1 与排除 HMOX1 的血红素代谢评分或炎症反应评分均无显著关联，调整血红素评分后残差关联也不显著，因此这些转录组数据不区分溶血或红系应激与髓系炎症，也不支持 HMOX1 的独立机制归因。公共队列可用的临床和人口学元数据不完整，尤其是比较组特定年龄、性别、合并症、疾病严重度和治疗协变量，阻止参与者水平亚组分层和多变量调整。分析使用固定公共队列，无法进行前瞻性功效计算；小队列和不完整协变量限制统计精度和泛化性。总之，公共转录组整合支持活动性 VL 中 IFN-gamma 相关炎症状态及与儿童 HLH 单核细胞的探索性跨区室汇聚。探索性 132 基因评分、M1 巨噬细胞关联、排除特征共表达模块和同研究分类器验证均为假设生成性。在提出 HLH 特异性、机制、诊断、预后或临床效用主张前，需要具备临床 HLH 表型的前瞻性队列和独立分子验证。结论翻译：这些公共数据集支持活动性 VL 中 IFN-gamma 相关炎症状态以及与儿童 HLH 的探索性跨区室汇聚。132 基因评分、解卷积、网络和分类器结果为假设生成性，不能确立 HLH 特异性、细胞因果性、独立外部效度或临床 HLH 预测。