《Frontiers in Immunology》：Pitfalls and diagnostic challenges in TRECS-based newborn screening for Artemis, FOXN1 and Moesin deficiencies
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基于T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles, TRECs）的新生儿筛查（newborn screening, NBS）彻底改变了严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, S
基于T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles, TRECs）的新生儿筛查（newborn screening, NBS）彻底改变了严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）的早期诊断，促进了在危及生命的感染发生前识别受累新生儿。然而，TRECs水平降低是胸腺输出受损的替代标志物，而非疾病特异性发现。相应地，低值可能源于T细胞发育过程中高度异质性且截然不同的生物学机制，其范围超出了经典的SCID表型。本研究描述了3例通过异常TRECs筛查识别出的先天性免疫错误（inborn errors of immunity, IEI）患者，他们随后被诊断为Artemis、FOXN1和Moesin缺陷。这些临床病例表明，原发性T细胞免疫缺陷可源于T细胞发育不同生物学水平的缺陷，具体分别涉及抗原受体V(D)J重排受损（为NHEJ缺陷和其他SCID疾病所特有）、胸腺基质微环境功能破坏以及外周淋巴细胞稳态受损。因此，在新生儿筛查阳性后优化临床结局，需要系统整合临床、免疫学和分子学发现。这一诊断策略应涉及具备先进流式细胞术和分子确认条件的专业免疫缺陷中心，以确保准确和明确的诊断。最终，从支持性治疗到确定性造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）或针对SCID患者的基因/酶治疗等治疗决策，必须由精确的潜在致病机制和特定的分子缺陷所指导。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
先天性免疫错误（inborn errors of immunity, IEI）是一组损害T细胞发育和功能的临床异质性、潜在危及生命的疾病，由淋巴细胞发育多个层面的缺陷引起。这些疾病可影响早期淋巴细胞定向分化（细胞因子信号传导、抗原受体重组和DNA修复）、胸腺基质微环境，以及淋巴细胞稳态的改变。严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）是该疾病谱中最严重的表现形式，其特征为适应性免疫严重受损，导致感染易感性增加、免疫失调、生长发育迟滞，若缺乏早期治疗干预，婴儿期死亡率极高。
基于T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles, TRECs）定量检测的新生儿筛查（newborn screening, NBS）在过去十年中彻底改变了SCID及其他非SCID T细胞淋巴细胞的早期检测。TRECs是胸腺细胞发育过程中体细胞V(D)J重排的副产物——游离DNA分子，可作为胸腺近期输出功能的替代标志物。由于这些环状DNA片段在细胞分裂过程中不复制，其在外周血中的定量检测可间接反映近期胸腺输出细胞（recent thymic emigrants, RTEs）和新生T细胞的产生情况。
然而，TRECs是胸腺新生成T细胞产生的生物标志物，而非疾病特异性标志物。因此，低水平或缺失的TRECs不仅可识别SCID婴儿，还可识别广泛的非SCID T细胞淋巴细胞减少症，包括胸腺发育或基质疾病（如FOXN1缺陷和综合征性胸腺发育不良）、其他与T细胞产生受损相关的先天性免疫错误、与早产或淋巴液丢失等相关的继发性T细胞淋巴细胞减少症，以及特发性形式。机制上，与SCID相关的胸腺生成减少源于影响T细胞发育不同层面的多种原发性遗传缺陷：细胞因子信号传导缺陷和代谢毒性；抗原受体重组、DNA修复机制以及TCR前/后检查点阻滞异常。同样，与非SCID T细胞淋巴细胞减少症相关的胸腺生成受损可源于先天或获得性免疫缺陷的不同分子和细胞机制。
尽管这些缺陷涉及不同的生物学区室，但最终汇聚于一个共同的可测量结局——初始T细胞胸腺输出减少，进而导致TRECs产生降低。因此，异常TRECs结果不应等同于SCID本身，而应视为继发于异质性生物学过程的T细胞淋巴细胞减少症的证据。确定异常TRECs结果的生物学基础对于准确诊断和适当的临床管理至关重要。
本研究旨在探讨基于TRECs的NBS及后续利用NGS和Sanger测序技术进行遗传评估所涉及的临床陷阱和解读挑战，强调需要建立更广泛的临床、免疫学和分子学框架。研究通过三个代表性病例，展示了不同的生物学机制——V(D)J重组和DNA修复缺陷（Artemis缺陷）、胸腺基质发育缺陷（FOXN1）和免疫相关肌动蛋白病（Moesin）——如何影响初始T淋巴细胞产生和TRECs，最终阐明TRECs定量反映的是普遍的生物学输出而非疾病特异性诊断。
二、主要技术方法
研究人员基于西班牙拉里奥哈、阿拉贡和纳瓦拉三个自治区的SCID新生儿筛查项目数据开展研究，覆盖2025年10月至2026年8月期间约12,388名筛查新生儿。TRECs拷贝数通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）在干血斑或DNA样本中定量检测。免疫表型分析采用流式细胞术评估T、B和NK细胞，基于CD45RA和CCR7表达定义初始、中央记忆、效应记忆和TEMRA T细胞亚群，并以CD4+CD31+CD45RA+淋巴细胞报告近期胸腺输出细胞。分子筛查采用三种不同的二代测序（next-generation sequencing, NGS）策略：基于扩增子的定制192基因IEI靶向面板（Ion Torrent PGM平台）、基于靶向杂交捕获的476基因IEI面板（MiSeq平台）以及全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）（DNBSEQ-G400平台）。所有候选胚系变异均通过Sanger测序验证并进行家系共分离分析。
三、研究结果
筛查项目总体结果
三个自治区的NBS项目在11个月内共筛查12,388名新生儿。22例（0.18%）初始TRECs结果异常，复测后9例仍异常，13例恢复正常。9例持续异常者中，2例在获得新样本前死亡；其余7例复采样本中，5例TRECs水平恢复正常，2例持续缺失或低水平。最终诊断包括：无SCID病例、1例非SCID T细胞淋巴细胞减少症、1例胸腺/基质缺陷、无遗传学未明确病例，以及5例包括早产在内的短暂性或继发性TRECs异常。
病例1：Artemis缺陷
患者为3周龄男性婴儿，因严重红皮病、生长发育迟滞及提示IEI的家族史转诊排除SCID。TRECs检测显示完全缺失（0/0拷贝），免疫学评估显示淋巴细胞减少（1830个/μL），T淋巴细胞严重减少（689个/μL），B细胞几乎完全缺失（1个/μL），NK细胞保存（977个/μL）。T细胞区室分析显示胸腺输出严重受损，近期胸腺输出细胞缺失，初始CD4+和CD8+ T细胞几乎完全缺失（分别为0.3%和0.2%），效应记忆CD4+ T细胞显著扩增（87.1%）。临床和免疫学发现提示Omenn综合征。
基于扩增子的靶向NGS最初未鉴定出致病分子缺陷，但显示DCLRE1C基因外显子7和8覆盖度显著丢失。Sanger测序鉴定出c.488A>G（p.Tyr163Cys）变异，最初被解读为杂合。然而，该结果与表型严重程度及Artemis缺陷预期的常染色体隐性遗传模式不符。进一步研究发现高度同源的DCLRE1CP1假基因干扰了该基因组区域的测序。通过设计靶向5%非同源区域的基因座特异性引物排除假基因干扰后，最终确认该变异在患者中为纯合状态，父母均为杂合携带者。根据ACMG/AMP指南，该变异被分类为可能致病性。这一病例凸显了假基因干扰导致致病性DCLRE1C变异误判的诊断陷阱。治疗后患者接受抗微生物预防、免疫球蛋白替代、营养支持及环孢素免疫抑制治疗，并接受了基于氟达拉滨和海曲泊帕的减低强度预处理方案的HLA全相合同胞供者异基因造血干细胞移植（HSCT）。移植后+100天免疫学评估显示T细胞、CD4+、CD8+和CD19+亚群恢复，临床改善，移植后5年存活良好，完全供者嵌合，无急慢性移植物抗宿主病。
病例2：FOXN1缺陷
患者为29+6周早产女性婴儿，因NBS显示TRECs完全缺失（0/0拷贝/打孔）转诊。出生后第一个月内出现全身性红皮病和全身性淋巴结肿大。免疫学评估显示严重淋巴细胞减少（803个/μL），T和B淋巴细胞显著减少（分别为48个/μL和337个/μL），NK细胞为主要循环淋巴细胞群体（400个/μL）。T细胞区室研究显示胸腺输出严重受损，近期胸腺输出细胞（0.25%）和初始CD4+、CD8+ T细胞（分别为0.6%和0.9%）严重减少，效应记忆T细胞在CD4+（77%）和CD8+（88%）区室中占主导，T细胞活化标志物显著升高。
全外显子组测序鉴定出FOXN1基因杂合移码变异c.1465del（p.Gln489ArgfsTer61），家系分析确认该变异遗传自患者母亲。根据ACMG/AMP标准，该变异被分类为致病性，确立单等位基因FOXN1缺陷诊断。患者母亲携带相同致病性变异，但临床表现显著较轻，表现为轻度外胚层特征（稀疏毛发和指甲营养不良）、CD4+ T细胞计数降低（483个/μL）及初始T细胞和近期胸腺输出细胞频率降低的成熟谱异常。这种家系内变异与单等位基因FOXN1缺陷的不完全外显、可变表达性和年龄依赖性免疫学演变一致。由于胸腺基质缺陷的本质、家族史及母亲相对温和的表型支持残余胸腺生成的存在，患者接受支持性治疗和系列临床免疫学监测的保守管理策略，而非立即进行HSCT。
病例3：Moesin缺陷
患者为男性婴儿，因NBS显示TRECs持续降低（11/14拷贝/打孔）转诊。20日龄时临床健康，但免疫学评估显示严重淋巴细胞减少（542个/μL），高度提示渗漏性SCID。免疫表型分析显示T和B淋巴细胞显著减少（分别为217个/μL和27个/μL），但T细胞区室分析显示初始CD4+ T细胞比例保存（83.4%），初始CD8+ T细胞比例较低（32%），近期胸腺输出细胞占CD4+ T细胞的65.3%，无T细胞活化标志物升高。
靶向NGS鉴定出MSN基因半合子错义变异c.511C>T（p.Arg171Trp），根据ACMG/AMP标准分类为致病性，确立X连锁Moesin缺陷诊断。该变异此前已在MSN相关免疫缺陷患者中有报道。患者接受临床和免疫学随访，系列评估确认持续性淋巴细胞减少，尽管初始T细胞亚群和近期胸腺输出细胞的相对比例得以保存。
四、讨论与结论
本研究表明，基于TRECs的NBS已从根本上改变了SCID的诊断和管理。异常TRECs结果后，在具备IEI专业知识的专科中心进行快速确认至关重要。临床和免疫学评估，包括快速评估、T/B/NK细胞免疫表型分析、初始和记忆T细胞区室表征、RTEs定量和早期分子检测，能够区分不同的生物学机制。最终目标是将这些生物学发现转化为个体化治疗策略。
三个病例展示了异常TRECs结果如何根据胸腺输出受损的潜在机制而需要显著不同的诊断路径和治疗方法。Artemis缺陷代表抗原受体重组和DNA修复的典型缺陷，DCLRE1C编码的Artemis是V(D)J重组过程中DNA双链断裂修复所需的非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）通路的关键组分。该病例的主要诊断挑战源于初始分子分析的技术局限性——扩增子NGS面板中DCLRE1C基因外显子7和8覆盖度缺失，原因是与DCLRE1CP1假基因的高度序列同源性（95%）导致引物结合位点内序列变异引起扩增失败（引物脱落）。这一技术局限性最初导致变异的错误杂合解读，尽管免疫学表型高度提示Artemis缺陷。后续基因座特异性Sanger测序解决了诊断问题，而回顾性分析显示基于杂交捕获的面板成功克服了这些局限性，为关键外显子提供了稳健均匀的覆盖度。
FOXN1缺陷病例代表了一种截然不同的机制类别，主要缺陷位于胸腺基质微环境而非造血区室。FOXN1编码对胸腺上皮细胞分化、维持和功能不可或缺的转录因子。该病例凸显了单等位基因FOXN1缺陷的显著表型异质性，先证者表现为严重的初始T细胞淋巴细胞减少、TRECs缺失和Omenn样表型，而携带相同致病性变异的母亲临床表现显著较轻但存在持续性免疫异常。与经典SCID不同，HSCT可能无法完全纠正FOXN1缺陷，因为主要缺陷位于胸腺上皮区室而非造血细胞。治疗决策应根据胸腺功能障碍的严重程度指导，严重先天性胸腺缺失时胸腺移植是首选确定性治疗，而具有残余胸腺功能和进行性自发免疫成熟的患者采用保守管理。
Moesin缺陷病例阐明了影响免疫相关肌动蛋白病的根本不同机制。Moesin是ezrin-radixin-moesin（ERM）家族成员，将质膜连接至肌动蛋白细胞骨架，在淋巴细胞黏附、迁移、免疫突触形成、细胞内信号传导和细胞存活中发挥核心作用。在Moesin缺陷中，V(D)J重组保持完整，允许T细胞受体重排。TRECs降低反映细胞能力受损、胸腺细胞成熟效率改变或外周淋巴细胞维持异常，而非受体生成本身的失败。该病例表明，降低的TRECs值并非 exclusively 与影响早期T细胞发育的缺陷相关，也可能源于淋巴细胞成熟和维持后期阶段的异常。
总之，这些病例描绘了T细胞发育的三级生物学模型：抗原受体重组和DNA修复、胸腺基质支持以及淋巴细胞细胞骨架调控和免疫稳态。降低的TRECs应被解读为胸腺输出受损的定量生物标志物，需要进一步的机制解析。治疗决策应由受累的生物学区室指导：造血缺陷如Artemis缺陷或其他SCID疾病适合HSCT或基因治疗；胸腺微环境疾病如FOXN1缺陷可能需要胸腺移植或根据残余胸腺功能进行保守随访；主要影响淋巴细胞稳态的疾病如Moesin缺陷需要基于其临床和免疫学演变进行个体化管理。研究结果强化了多维诊断策略的必要性，该策略将NBS结果与详细免疫表型分析、功能研究和遗传学研究整合于专业临床、免疫学和HSCT中心，以实现IEI患者的准确诊断和基于机制的治疗决策。
