全基因组测序揭示东部刚果民主共和国南基伍省利福平耐药肺结核患者中结核分枝杆菌复合群 Lineage 8 (L8) 的本地多样化与祖先基因组特征

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Mycobacterium tuberculosis complex Lineage 8 causes drug resistant pulmonary tuberculosis also in South Kivu, Eastern Democratic Republic of Congo

背景：Lineage 8 (L8) 作为所有其他已知结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）谱系的姐妹支，占据独特的系统发育位置。尽管 L8 菌株的初步鉴定仅限于卢旺达和乌干达，但由于东部和中部非洲基因组监测有限，该谱系的完整地理分布仍未确定。方法：研究人员对来自刚果民主共和国（Democratic Republic of Congo, DRC）东部南基伍省布卡武的利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis, TB）患者痰标本中的 MTBC 分离株进行了全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。使用 TBProfiler 进行谱系分配，分类基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）。针对来自卢旺达和乌干达的公开 L8 参考基因组，采用最大似然分析进行系统发育重建。通过 WGS 数据的基因型预测和表型药物敏感性试验确定耐药谱。临床和流行病学数据从项目记录中提取。结果：在2023年1月至12月于布卡武收集的15株经 Xpert Ultra 确定为利福平耐药 TB 富集的测序分离株中，研究人员鉴定出3株属于 MTBC L8 的临床分离株。系统发育分析确认其位于 L8 分支内，同时揭示其 SNP 谱独特，分别与先前发表的卢旺达和乌干达 L8 菌株相差16–20至>200个 SNPs，与本地多样化而非近期跨境输入相一致。L8 特征性祖先基因组特征得以保留，包括完整的 cobF 区域和完整的 pks8 基因。基因组数据耐药预测提示耐多药结核病（multidrug-resistant TB, MDR-TB）和准广泛耐药结核病（pre-extensively-resistant TB）。结论：本报告将 MTBC L8 的已知地理分布扩展至 DRC 东部，支持非洲大湖区藏有结核杆菌未充分表征的祖先多样性的假说。需要在 DRC-乌干达-卢旺达-布隆迪走廊开展系统性基因组监测，包括利福平敏感分离株，以确定 L8 是罕见孑遗谱系还是通过区域传播网络循环的未被充分检测的地方性变异。

研究背景：结核病（tuberculosis, TB）仍是全球单一致死感染因子导致死亡的首位原因，2024年估计在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）阴性人群中导致130万死亡，在HIV感染者中另有167,000死亡。TB由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）引起，该复合群包括至少10个人类适应谱系（L1-L10），其地理分布反映宿主人群迁移历史。谱系间在毒力、传播力、免疫原性和耐药倾向上存在差异，理解其系统发育多样性和地理范围对TB控制、疫苗、诊断及治疗结局具有重要意义。非洲是唯一发现所有已知MTBC谱系的大陆，支持MTBC起源非洲后随人类迁移全球扩散的假说。2020年，Ngabonziza等从卢旺达一例耐多药TB（multidrug-resistant TB, MDR-TB）患者和乌干达一例患者中描述了L8，二者共享rpoB Asp435Tyr突变。系统发育显示L8是所有其他已知MTBC谱系的姐妹支，位于M. canettii和经典MTBC最近共同祖先之间。L8保留其他已知MTBC谱系中已缺失的祖先基因组区域，包括参与钴胺素（维生素B₁₂）生物合成的完整cobF区域和完整pks8基因；pks8在L1-L7共同祖先中被移码突变中断。东部DRC南基伍省位于非洲大湖区地理和人口交汇处，布卡武与卢旺达Cyangugu（Rusizi）仅一桥之隔，南邻布隆迪；数十年武装冲突、人口流离和跨境迁移有利于TB传播和分枝杆菌群体混合。然而东部DRC MTBC菌株分子特征极其有限，尚无系统基因组监测发表，L8是否超出卢旺达和乌干达未知。因此研究人员报告首次从南基伍临床标本中鉴定和系统发育表征L8，描述基因组特征，比较耐药相关突变，呈现患者临床流行病学特征，并讨论其对TB分子监测和大湖区合作的意义。

关键技术方法：研究样本来自南基伍项目性利福平耐药TB痰标本，经Xpert MTB/RIF Ultra确认，送至卢旺达生物医学中心（Rwanda Biomedical Centre, RBC）进行表型药物敏感性试验（phenotypic drug-susceptibility testing, pDST）。对2023年1—12月布卡武收集的RR-TB分离株进行WGS；使用TBProfiler进行谱系分配和耐药预测；用MTBseq映射至H37Rv，构建SNP比对，RAxML NG最大似然法（GTR加gamma模型，含Stamatakis校正，200次bootstrap）与公开L8参考基因组重建系统发育；评估cobF区域和pks8基因完整性；采用描述性统计。

研究结果：
Clinical and epidemiologic characteristics（临床和流行病学特征）：从南基伍不同TB诊断中心收集96份痰标本，来自58例患者，包括RR-TB、复治诊断和随访标本。26份培养阳性，其中16份MDR-TB；15份RR-TB进行WGS，TBProfiler鉴定3株L8。pDST与WGS预测在所有测试药物一致。3例L8感染者为男性，中位年龄39岁（四分位距IQR 24—47）；1例无既往TB治疗史，2例既往RR-TB治疗失败；均HIV阴性。标本采集地包括Kadutu卫生区CBCA Nyamungo、Kitutu综合医院和Walungu综合医院。居住地分别为布卡武市、Kitutu（距布卡武212 km）和Walungu（距布卡武45 km）。通过国家TB项目登记未发现3例患者间社会或流行病学联系。

Phylogenetic reconstruction（系统发育重建）：3株南基伍L8与1株乌干达和2株卢旺达公开L8基因组分析。最大似然树中3株南基伍聚集一起。基于231个可变位点，南基伍与乌干达分离株成对SNP差异18—26，与卢旺达199—209；南基伍内部差异9、11、12。按已发表0.3—0.5 SNPs/基因组/年替代率外推约18—40年，但这是外推而非正式分子定年。

Preservation of ancestral genomic features（祖先基因组特征保留）：区域差异分析确认南基伍L8保留祖先cobF基因区域；该区域在L1-L7、L9-L10和动物适应谱系中缺失。cobF区域存在且读段覆盖均一（区域中位深度144、104、99），无破坏证据。pks8编码序列完整，无中断H37Rv参考和其他现代MTBC谱系pks8/17的1核苷酸移码缺失。该结果与原始L8系统发育位置和祖先特征一致。

Drug resistance profile（耐药谱）：WGS基因型耐药预测显示3株南基伍L8均携带rpoB His445Leu和katG Ser315Thr突变；2株额外携带inhA Ser94Ala突变，1株携带gyrA Asp94Gly突变。未检测到提示异质性耐药的混合耐药谱。预测为MDR-TB和pre-extensively-resistant TB。pDST与WGS预测一致。

讨论总结：研究人员报告东部DRC首次鉴定M. tuberculosis L8，扩展该深分支祖先谱系已知地理范围至卢旺达和乌干达以外。系统发育确认南基伍分离株属于L8，与卢旺达和乌干达菌株相关；与先前指定L8菌株SNP距离<1000，符合Coscolla等定义cut-off。尽管均为MDR，南基伍L8共享不同于“Rwanda-Uganda”L8的rpoB突变。菌株保留L8定义性祖先基因组特征，包括完整cobF和完整pks8。该发现与卢旺达和乌干达既往报告一致，扩展非洲大湖区L8地理分布。虽仅3株，支持该区域存在不常见MTBC谱系，需更广泛基因组监测确定频率和分布。L8最初描述留下其是地理限制孑遗还是因监测有限而未被发现的疑问；东部DRC三个遗传不同L8分离株支持后一种可能并扩展分布。但数据未确立长期循环或传播，需更大规模人群基因组研究确定患病率、进化史和传播模式。L8系统发育位置和祖先区域保留使其成为理解MTBC早期进化事件的关键参照。南基伍位于DRC、卢旺达、布隆迪交汇处，跨境迁移、流离和贸易密集；布卡武与Rusizi构成跨国城市走廊，每日数千跨境。东部DRC数十年冲突导致大规模人口移动，是TB传播和病原群体遗传混合的已知驱动因素。在此背景下，南基伍发现L8并不意外，而是预期。南基伍与卢旺达L8 SNP距离提示可能是近期单次引入，但也反映该谱系已建立区域存在，与跨大湖区多年至数十年持续传播一致。原L8菌株均为MDR，曾引发L8是否内在耐药担忧；但这可能是监测偏倚，因菌株来自针对性MDR-TB诊断试验DIAMA，优先采样耐药。本研究筛选也富集耐药和复治，初分离回收率低，无法无偏估计L8区域患病率。耐药突变比较显示L8与共循环菌株rpoB突变模式不同；南基伍L8均共享His445Leu，而Ser450Leu是全球南基伍最常见rpoB突变。由于L8耐药模式不同，预期野生型L8也在中非循环；需系统分析利福平敏感MTBC，如全国耐药调查充分代表东部DRC。进化上，L8保留cobF和pks8，提出代谢能力、细胞壁组成和宿主-病原互作差异问题；现代谱系cobF丢失是宿主维生素B₁₂依赖适应，pks8保留功能意义不明，需实验验证。TB监测控制意义：需了解MTBC多样性与毒力致病性；研究抗TB药物最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations, MICs）以探究谱系特异性药敏；全国耐药调查正在DRC进行，但南基伍仅34个卫生区中1个纳入，主要因安全限制。跨境分布支持区域TB分子监测；大湖区共享流行病学、人口流动和独特病原谱系，应建立协调基因组监测网络。DRC 2024报告超过270,000 TB病例，几乎未进行WGS谱系分类。临床角度，L8鉴定目前不改变TB诊断或治疗；南基伍分离株通过常规WHO认可分子诊断算法检出，表明当前推荐检测仍适用。WGS附加价值在于将菌株置于不常见MTBC谱系并提供耐药相关突变高分辨特征。随着测序能力扩展，将基因组数据整合入国家监测项目，符合WHO建议，将改善不常见MTBC谱系检测、支持跨境传播调查并细化TB群体结构理解。局限包括L8分离株少，限制患病率估计和统计比较，不能确定临床表型或传播动态；标本来自三个设施项目诊断，富集复杂治疗史和确认耐药，便利样本不能准确估计L8比例；仅RR分离株测序，选择偏倚，无法评估药物敏感L8是否循环；无接触追踪；无布隆迪和其他DRC省份WGS限制地理范围定义。系统发育关系解释需谨慎，因可用基因组少且变异位点有限；人群富集RR和MDR，独立获得耐药突变可能同塑性（homoplasy）影响距离。Yenew等使用ClonalFrameML考虑重组；本研究分子钟仅用于密切相关的南基伍分离株粗略外推，不推断L8引入时间和方向。未评估L8分离株pks5状态，限制评估pks5融合事件相对于L8分化的时间。

研究结论翻译：研究人员报告东部DRC首次鉴定M. tuberculosis L8，扩展该深分支祖先谱系在非洲大湖区的已知地理分布。南基伍分离株与先前卢旺达和乌干达报告分离株之间观察到的遗传差异提示，L8在该区域循环的时间可能比目前认识更长。鉴于测序分离株数量有限，该解释应视为需通过更大规模基于人群的基因组监测研究确认的假说。研究结果表明，大湖地区可能藏有先前未识别的MTBC多样性，支持扩大东部DRC基因组监测以阐明L8分布、传播模式和进化史。