柱后点样-溶剂蒸发液相色谱-拉曼光谱（LC-Raman）用于无衍生化氨基酸的纳克级检测、结构鉴别与定量分析

《Analyst》：Sensitive and derivatization-free amino acid analysis using liquid chromatography-Raman spectroscopyOpen Access

液相色谱-拉曼光谱（LC-Raman）结合柱后点样和溶剂蒸发，实现了无需衍生化的氨基酸纳克级检测，并证明了在该水平对苯丙氨酸和谷氨酰胺进行定量的可行性。无论发色团（chromophore）是否存在，所有20种氨基酸均被成功检测。通过不同的振动指纹图谱直接区分了赖氨酸修饰。共洗脱化合物通过基于多元曲线分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）的光谱解卷积得以分离，表明LC-Raman光谱可为色谱分析增加光谱分离轴。此外，LC-Raman光谱还被用于定量分析。对于苯丙氨酸和谷氨酰胺，校准曲线表现出优异的线性（苯丙氨酸R² = 0.9925，谷氨酰胺R² = 0.9994）。通过LC-Raman光谱获得的培养基中这些氨基酸的定量结果（苯丙氨酸65.9 ± 3.5 μg mL^?1（n = 3，%RSD = 5.2%）；谷氨酰胺576.3 ± 17.5 μg mL^?1（n = 3，%RSD = 3.0%））与传统检测器测定结果（苯丙氨酸66.1 μg mL^?1；谷氨酰胺584 μg mL^?1）吻合良好。这种无标记方法确立了LC-Raman光谱作为LC的结构检测模式，使色谱分析能够直接与分子指纹图谱（molecular fingerprinting）耦合。

论文解读：柱后点样-溶剂蒸发液相色谱-拉曼光谱（LC-Raman）用于无衍生化氨基酸分析

研究背景与问题
氨基酸分析对评价细胞培养基、生物流体和代谢物提取物等复杂生物基质至关重要，因为氨基酸既是蛋白质构建单元，也指示细胞代谢、营养消耗和生理状态。复杂样品要求检测化学多样的氨基酸、区分结构相近化合物，并以最少前处理定量目标物。液相色谱（LC）常与紫外（UV）、荧光或质谱（MS）检测联用，但UV/荧光依赖光学响应，对缺乏强发色团的氨基酸常需衍生化；MS灵敏度高并提供分子质量信息，但异构体和修饰氨基酸等结构相近化合物的区分可能需优化离子化和碎裂条件。拉曼光谱（Raman spectroscopy）直接探测分子振动，提供完整化合物的内在光谱指纹，有望将LC转变为分离-结构指纹平台。然而，拉曼散射弱，通常10⁶–10⁸个光子中约1个发生非弹性散射，分子振动截面约10^?30–10^?28 cm²。在线流池LC-Raman灵敏度不足且溶剂干扰强；表面增强拉曼散射（SERS）受基底依赖、重现性和定量限制；离线微分配器LC-Raman虽可提高灵敏度、抑制溶剂干扰，但样品损失和斑点异质性限制定量。为此，研究人员开发柱后点样结合溶剂蒸发的LC-Raman系统，将稀液体样品转化为浓缩固体沉积，增强拉曼信号并消除溶剂干扰，同时用沉积物映射减轻斑点异质性，用于全面氨基酸分析。

研究开展与总体结论
研究人员提出柱后点样和溶剂蒸发LC-Raman平台，通过将稀LC馏分转化为浓缩干燥沉积并进行拉曼映射，增强可检测性、降低溶剂干扰并减轻斑点异质性。以氨基酸分析为严格测试，因为其包含弱发色团、结构相似异构体和生物学重要修饰。结果表明，单一LC-Raman流程可实现20种氨基酸的无衍生化检测、赖氨酸修饰直接区分、共洗脱化合物光谱解析和培养基中选定氨基酸定量。这确立LC-Raman作为LC的无标记结构检测器。

关键技术方法
分析样本包括20种氨基酸标准品、N^ε-acetyl-l-lysine、N^ε,N^ε,N^ε-trimethyllysine hydrochloride及DMEM培养基（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.）。系统为Nexera LC配光二极管阵列（PDA），柱后9:1分流，10%洗脱液自动点样于STA μFocus板（2.5 mm孔、700 μm亲水中心），室温干燥。分离用intrada amino acid柱（150 mm × 2 mm I.D., 3 μm），乙腈/甲酸与乙腈/100 mM甲酸铵梯度，0.2 mL min^?1。拉曼测量用532 nm激光、100×/0.90 NA物镜，功率0.01–1.0 mW；采用拉曼映射，MCR-ALS解卷积，并对l-phenylalanine和l-glutamine构建五点校准曲线。

研究结果
20种氨基酸的无衍生化检测。LC-Raman分析中，20种氨基酸色谱分离足以采集单个拉曼光谱，无需衍生化。分析物不依赖保留时间或光吸收，而由内在拉曼指纹识别。常规PDA仅观察到4种氨基酸（l-phenylalanine、l-tryptophan、l-tyrosine、l-methionine）的紫外吸收，而LC-Raman无论发色团存在与否均可检测。芳香族氨基酸显示环呼吸模式（l-phenylalanine: 1001 cm^?1；l-tryptophan: 1010 cm^?1；l-tyrosine: 1176 cm^?1）；含硫氨基酸显示C–S伸缩（l-methionine: 698 cm^?1）；脂肪族氨基酸显示烷基侧链振动。光谱与参考一致，重现性良好。

灵敏度评价。以l-phenylalanine为模型，计算1001、1596和3035 cm^?1三个拉曼谱带的信噪比（S/N）。S/N随浓度成比例增加，50 μg mL^?1时超过500；10 μg mL^?1（2 μL进样仅20 ng）时三个谱带S/N仍高于10（11.8、10.1、16.8）。考虑9:1分流和峰分散至1–2孔，每孔实际分析约1–2 ng。该无衍生化纳克级检测说明溶剂蒸发和固态浓缩克服了拉曼传统灵敏度限制。板孔疏水外表面和700 μm亲水中心限制液滴扩散；拉曼映射覆盖整个沉积区域并平均异质性，减轻而非完全消除干燥异质性。

赖氨酸修饰的结构鉴别。分析l-lysine及N^ε-acetyl-l-lysine和N^ε,N^ε,N^ε-trimethyllysine。N^ε-acetyl-l-lysine显示酰胺I振动1641 cm^?1和N–H伸缩3320 cm^?1，未修饰赖氨酸缺失；N^ε,N^ε,N^ε-trimethyllysine显示N-甲基C–H伸缩3027 cm^?1，不同于赖氨酸烷基链2931 cm^?1。传统LC检测器报告保留时间及光学或质量信息，而拉曼提供反映化学键和功能团的内在振动指纹，可增加分子结构选择性。

DMEM培养基分析与共洗脱化合物解卷积。在DMEM培养基中，相同条件下通过保留时间和拉曼光谱直接鉴定8种主要氨基酸：l-phenylalanine、l-leucine、l-isoleucine、l-tyrosine、l-valine、l-glutamine、l-cystine和l-arginine。尽管含强荧光酚红，这些化合物在532 nm下经LC分离后仍被检测。部分化合物未检测，原因包括低浓度、干扰、拉曼散射效率差异及缺乏特征谱带；无可用拉曼谱带的化合物无法通过数据处理恢复。l-leucine和l-isoleucine馏分含共洗脱葡萄糖。MCR-ALS无需参考光谱，从重叠信号中提取l-leucine、l-isoleucine和葡萄糖组分谱，且与标准品高度一致，表明LC-Raman提供色谱分离之外的光谱解卷积轴。

苯丙氨酸和谷氨酰胺定量。测定培养基中l-phenylalanine和l-glutamine。校准曲线五点：l-phenylalanine 40–100 μg mL^?1，l-glutamine 400–1000 μg mL^?1，n = 3。l-phenylalanine用0.1 mW在1001 cm^?1芳香环呼吸带；l-glutamine用1.0 mW在2922 cm^?1C–H伸缩带。每个斑点全区域映射，平均光谱，特征带峰强度作代表值，多孔信号求和。l-phenylalanine在40–100 μg mL^?1内R² = 0.9925，l-glutamine在400–1000 μg mL^?1内R² = 0.9994；最低浓度%RSD分别为9.06（n = 3）和8.36（n = 3）。DMEM中测得l-phenylalanine 65.9 ± 3.5 μg mL^?1（n = 3，%RSD = 5.2%），l-glutamine 576.3 ± 17.5 μg mL^?1（n = 3，%RSD = 3.0%），与UV检测器66.1 μg mL^?1和MS检测器584.0 μg mL^?1吻合良好。最低校准浓度40 μg mL^?1对应2 μL进样80 ng，考虑分流和峰分散，每孔实际分析约4–8 ng。离线流程通量受限：LC分离40分钟，干燥30分钟，拉曼测量数小时；最大l-phenylalanine沉积面积约0.04 mm²，5 μm间隔约1600点，每孔最多400分钟。当前流程优先灵敏度和结构特异性，未来需减少映射面积、浓缩沉积和优化间隔以提高通量。

讨论与结论
讨论部分表明，柱后点样、溶剂蒸发和拉曼映射解决了灵敏度、溶剂干扰及斑点异质性障碍，实现无衍生化检测、结构鉴别、共洗脱解析和定量；但离线通量受LC分离、干燥和拉曼映射时间限制，激光功率需优化，校准仅在验证范围内使用，y截距作为经验模型一部分，可能来自响应曲率、背景、基线变化和斑点异质性。未检测化合物反映当前检测限，可能源于低浓度、弱拉曼散射效率、与培养基成分重叠或缺乏特征拉曼谱带。
研究结论翻译：本研究确立LC-Raman光谱为一种强有力的分析工具，成功解决了拉曼检测历史上的灵敏度限制，同时保留其在分子鉴定方面的独特优势。通过策略性柱后浓缩和固态测量，实现了纳克级检测，并证明苯丙氨酸和谷氨酰胺定量的可行性，使稀生物样品的实际分析成为可能。所有20种氨基酸均在无需衍生化条件下被成功检测，对应翻译后修饰的赖氨酸衍生物通过其振动特征被直接区分，共洗脱化合物通过基于MCR-ALS的光谱解卷积得以解析，突显LC-Raman光谱将色谱分离与振动光谱分离相结合的能力。此外，基于苯丙氨酸和谷氨酰胺拉曼信号的浓度依赖性构建校准曲线，证明了LC-Raman方法的定量能力。这些能力确立LC-Raman光谱作为LC的结构检测模式，其中色谱分离直接与无标记振动指纹图谱耦合。该方法不仅可作为附加检测器，还为基于本征拉曼特征进行分子鉴定和比较提供途径，为氨基酸及其他拉曼活性化合物的LC分析开辟新方向。