系统性红斑狼疮与干燥综合征外周免疫细胞图谱的单细胞质谱流式分析：揭示疾病特异性免疫差异

《Frontiers in Immunology》：Single-cell mass cytometry cartography highlights systemic lupus erythematosus and Sj?gren’s disease immune differences

目的： 原发性干燥综合征（primary Sj?gren’s disease，pSjD）和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等自身免疫性疾病具有共同的临床和血清学特征，包括Ⅰ型干扰素（type I interferon，IFN）特征、自身抗体形成和慢性炎症，但其潜在的免疫病理机制并不相同。为支持靶向治疗策略的开发，研究人员旨在系统性地表征pSjD和SLE患者与健康供者（healthy donors，HD）相比外周免疫细胞亚群中疾病特异性的改变。 方法： 研究人员通过质谱流式细胞术（mass cytometry，CyTOF）分析了来自15名HD、12名pSjD患者和21名SLE患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。研究人员在开展高维共识聚类（consensus clustering）分析前，先手动预设门控筛选存活的CD19+ B细胞、CD3+ T细胞和固有免疫细胞群体。研究人员比较了三个队列之间各亚群的相对频率和标志物表达，包括共刺激受体和抑制性受体。 结果： 在B细胞区室中，研究人员鉴定了13个聚类。SLE患者表现出浆母细胞（plasmablasts）以及两个双阴性（double-negative，DN，即IgD?CD27?）B细胞聚类的相对扩增，其中一个为CD21?，另一个为高表达IgA的CD19low。两者均具有活化表型，表现为CD38、CD86和Ki-67表达升高。在SLE中，共刺激分子CD86和CD226在记忆B细胞和DN B细胞上表达上调。相比之下，pSjD中的B细胞改变较为温和。研究人员鉴定了12个T细胞聚类。两种疾病中CD4+ PD-1+ ICOS+循环滤泡辅助性T样细胞（circulating T follicular helper-like cells）均增加，而pSjD表现出CD8+效应记忆T细胞（effector memory T cells，Tem）和终末分化T细胞（terminally differentiated T cells，Temra）亚群的扩增。固有免疫细胞的相对频率在各组间无显著差异，然而SLE中CD226hi中间型单核细胞减少，但表现出更高的活化标志物表达（CD86、HLA-DR）。网络相关性分析显示，SLE中免疫细胞连接性高于pSjD。 结论： SLE以B细胞活化、浆母细胞扩增和共刺激分子上调为特征，而pSjD主要以外周CD8+ T细胞区室的改变为特征。这些疾病特异性的免疫学特征凸显了SLE和pSjD中不同的免疫模式，并为未来研究靶向治疗策略提供了假说基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

原发性干燥综合征（pSjD）和系统性红斑狼疮（SLE）均为病因不明且多因素参与的炎症性风湿性疾病。两种疾病在临床上共享诸多特征，包括B细胞淋巴瘤风险增加、补体系统活化、DNA甲基化表观遗传模式异常，以及显著的Ⅰ型干扰素（IFN）基因特征。然而，尽管两者均被认为是B细胞驱动的疾病，利妥昔单抗（rituximab）在pSjD和SLE中的临床试验均未一致达到主要终点，提示两种疾病潜在的免疫病理机制存在本质差异。T细胞在两种疾病的发病中均发挥重要作用，特别是滤泡辅助性T细胞（Tfh）通过驱动自身反应性B细胞成熟和自身抗体过度产生而参与疾病过程。固有免疫细胞，尤其是髓系细胞，是Ⅰ型干扰素的主要来源，通过Toll样受体（TLRs）识别含核酸的免疫复合物或自身抗原而触发干扰素产生。然而，此前尚无研究对SLE和pSjD的适应性免疫和固有免疫区室进行并排的高维比较。因此，研究人员采用质谱流式细胞术（CyTOF），对pSjD、SLE和健康供者（HD）的外周B淋巴细胞、T淋巴细胞及固有免疫细胞进行高维图谱分析，旨在系统揭示两种自身免疫性疾病之间细微但可能重要的免疫差异，为精准靶向治疗策略的开发提供理论基础。

二、主要技术方法

本研究共纳入15名健康供者、21名SLE患者和12名pSjD患者，样本来源于柏林夏里特医学院（Charité Universit?tsmedizin Berlin）的伦理委员会批准队列。研究人员从肝素抗凝外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）并冻存。采用Helios质谱流式仪器（Fluidigm）进行样本采集，分别应用B细胞特异性抗体面板和T细胞/固有免疫细胞面板。数据经FlowJo手动预设门控后，使用R语言CATALYST包进行FlowSOM聚类和ConsensusClusterPlus共识聚类，并通过均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维可视化。绝对淋巴细胞计数通过BD Multitest 6-Color TBNK试剂结合Trucount管进行流式测定。此外，研究人员通过共享标志物相关性分析（Pearson相关系数>0.85）和最近邻（NN）映射方法，将含检查点分子（CPM）面板的数据投射到B细胞参考聚类上，从而实现对B细胞亚群检查点分子表达的整合分析。网络相关性分析采用Spearman秩相关（p<0.01，|ρ|>0.5）构建无向相关网络，并量化网络拓扑指标。

三、研究结果

IgD^?CD27^?双阴性B细胞聚类在SLE患者中增加并呈现活化表型

通过共识聚类分析，研究人员在B细胞区室中鉴定出13个聚类，涵盖过渡型B细胞、初始B细胞、前转换记忆B细胞（psw）、记忆B细胞（mem）、双阴性（DN）B细胞和浆母细胞（PB）等亚群。多维尺度分析（MDS）显示HD样本聚集良好，而SLE和pSjD表现出更高的异质性。差异丰度分析发现，SLE患者中浆母细胞聚类（PB、PB-HLA-DR、PB IgM）总体显著增加，两个DN B细胞聚类（DN CD21^?和DN CD19^low）也显著扩增。其中DN CD19^low聚类高表达IgA和CD38，在MDS分析中与浆母细胞聚类邻近，提示其可能为CD19^lowCXCR5^?抗体分泌细胞前体。这两个DN聚类均缺乏CD21（补体受体2型）表达，且呈现活化表型，表现为CD38、CD86和Ki-67表达升高。SLE中多个B细胞聚类整体CD21表达降低，而CD21阴性聚类表现出更高的CD38表达。在活化标志物方面，SLE患者的多种B细胞聚类上CD86表达升高，CD23表达下调，mem IgA聚类表现出较高的CD86、Ki-67和CD45RO表达，提示其近期被激活。相比之下，pSjD的B细胞改变较为温和，仅观察到psw记忆B细胞减少。

CD4⁺ PD-1⁺ ICOS⁺、CD8⁺ Tem和CD8⁺ Temra T细胞聚类在pSjD患者中增加

T细胞区室聚类分析鉴定出12个聚类，包括6个CD4⁺、4个CD8⁺和2个CD4/CD8双阴性聚类。差异丰度分析显示，CD4⁺ PD-1⁺ ICOS⁺循环滤泡辅助性T样细胞聚类在SLE和pSjD中均显著增加。在CD8⁺区室中，pSjD患者表现出CD8⁺初始T细胞减少，而CD8⁺ Tem和CD8⁺ Temra聚类比例增加，后者在SLE中也有增加但程度较轻。此外，SLE中CD4/CD8双阴性γδ TCR Tcm聚类减少。在标志物表达方面，CD4⁺ PD-1⁺ ICOS⁺聚类在SLE中TIGIT表达更高，在SLE和pSjD中PD-1表达均升高。CD8⁺ Temra聚类在pSjD中HLA-DR表达增加。活化标志物分析显示，SLE中CD8⁺记忆T细胞聚类CD38表达上调，Ki-67在SLE的CD8⁺ Tcm和pSjD的CD8⁺初始T细胞中上调，两种疾病中CD8⁺ Temra和γδ TCR Tcm的Ki-67均升高。

固有免疫细胞分析揭示pSjD与SLE中亚群特异性活化和调节标志物改变

固有免疫细胞聚类鉴定出13个聚类，包括6个单核细胞聚类（经典单核细胞CM、中间型单核细胞IM各按CD226表达分为两个亚群、非经典单核细胞NCM和CD226^hi M）、2个CD123^bright聚类（浆细胞样树突状细胞pDC和类嗜碱性粒细胞）以及自然杀伤细胞（NK）相关聚类。差异丰度分析显示，仅IM CD226聚类在SLE中相对于pSjD显著减少。在标志物表达方面，IM CD226聚类在pSjD和SLE中CD86表达均上调，pSjD中CD16表达轻度升高。SLE的IM和NCM聚类呈现更高的CD86表达，提示活化表型。NK细胞在两种疾病中CD45RA表达降低、CD69表达升高，提示向活化表型转变，其中Ki-67仅在SLE中升高。pDC聚类在两种疾病中CD38表达增加，SLE中CD69表达升高。

相关性分析揭示pSjD和SLE中不同的免疫细胞共变模式

研究人员将B细胞、T细胞和固有免疫细胞亚群频率进行整合，构建了各队列的Spearman相关网络。SLE队列表现出最高的网络连接性，平均度、网络密度和平均介数中心性均高于pSjD和HD，提示SLE中存在跨免疫区室的广泛免疫激活和紧密关联的调控网络。在SLE网络中，浆母细胞聚类、DN CD19^low聚类和活化的CD4⁺ PD-1⁺ ICOS⁺ T细胞之间呈现强正相关，形成共变群体。相比之下，pSjD队列呈现更为分离的相关模式，其中CD8⁺ Tcm、CD8⁺ Tem和CD8⁺ Temra与CD4⁺初始T细胞呈负相关，且CD8⁺ Temra与CD21^?初始B细胞相关，提示抗原经历型T细胞与非典型B细胞之间存在共调控。

CPM分析显示SLE中共刺激受体表达模式改变

通过数据集整合和最近邻映射，研究人员分析了B细胞、T细胞和固有免疫细胞亚群上抑制性和共刺激性检查点分子的表达。BTLA在B细胞上呈分化依赖性表达模式：初始B细胞最高，经典记忆B细胞下调，浆母细胞重新上调。ICOS在SLE的CD4⁺初始、Tcm和DN聚类上选择性升高。TIGIT在两种疾病的CD4⁺ Tcm上均增加，pSjD表现出更广泛的CD4⁺亚群TIGIT增强。CD226在SLE中于过渡型和记忆B细胞及CD226^hi单核细胞上特异性上调。CD86在SLE中于多种抗原经历型B细胞状态（psw、psw CD21^?、mem、mem IgA、DN和DN CD21^?）上强烈上调。VISTA在两种疾病的所有T细胞聚类上均上调，并在CD21^?和浆母细胞B细胞上选择性增加（SLE>pSjD），固有免疫细胞（单核细胞、类嗜碱性粒细胞和NK亚群）也表现出显著的VISTA增加。PSGL-1在pSjD中优先升高，特别是在初始和DN T细胞亚群中。PD-1/PD-L1轴在两种疾病的CD4⁺记忆和CD4⁺ PD-1⁺ ICOS⁺ T细胞上最显著活化，B细胞上PD-1和PD-L1在CD21^? psw和DN B细胞上特异性增加。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，SLE以B细胞活化、浆母细胞扩增和共刺激分子（ICOS、CD86、CD226）上调为特征，而pSjD以细胞毒性T细胞富集和抑制性检查点分子（TIGIT、VISTA、PSGL-1）上调为特征。SLE中DN B细胞和浆母细胞的扩增及其与活化T细胞的网络关联，支持B-T细胞相互作用在维持疾病活动中的关键作用。pSjD中CD8⁺记忆T细胞的扩增提示持续的抗原刺激驱动的细胞毒性免疫应答。抑制性检查点分子的上调可能反映机体内在的免疫调节补偿机制。研究结论强调，SLE中DN B细胞扩增和Tfh-B细胞共刺激轴的激活可能为未来疾病相关的细胞和分子靶点研究提供方向，而pSjD中抑制性检查点分子的表达增加则值得进一步的功能学研究。该研究受限于队列规模较小（尤其pSjD组）、横断面设计无法评估时间动态和因果关系，以及检查点分子分析依赖于两个CyTOF面板的整合。未来需要在更大规模、纵向队列中验证这些发现并探索其功能意义。