《Plant Biotechnology Journal》：A Lambda Red Recombinase-Assisted CRISPR/Cas9 System for Efficient and Precise Genome Editing in Agrobacterium tumefaciens
编辑推荐：
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物遗传转化的强大递送工具，也是农业生物技术的关键平台。然而，根癌农杆菌实验室菌株数十年来在遗传上未得到优化，其基因组工程受限于低效的内源同源重组（homologous recombinatio
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物遗传转化的强大递送工具，也是农业生物技术的关键平台。然而，根癌农杆菌实验室菌株数十年来在遗传上未得到优化，其基因组工程受限于低效的内源同源重组（homologous recombination, HR）系统。在此，研究人员开发并优化了一种λ（lambda）Red重组酶辅助的CRISPR/Cas9系统，可将点突变、插入、缺失和大片段替换高效且精准地引入不同根癌农杆菌菌株的染色体和Ti（tumour-inducing）质粒中，且脱靶编辑极少。18个靶位点的编辑效率范围为26.7%至100%，证明了该方法的通用性。此外，研究人员在系统中加入了SacB反向筛选标记，便于编辑后质粒消除。利用该平台，研究人员在EHA105菌株中依次删除四个抗生素抗性位点，获得抗生素敏感衍生菌EHA105-S，其保持野生型生长动力学和转化效率。另外，研究人员对两个延伸因子Tu（elongation factor Tu, EF-Tu）基因的微生物相关分子模式（microbe-associated molecular patterns, MAMPs）进行工程改造，使根癌农杆菌逃避EF-Tu受体（EF-Tu receptor, EFR）识别。所得工程菌在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中表现出增强的瞬时表达效率。因此，该λ Red辅助CRISPR/Cas9系统为根癌农杆菌基因组工程提供了稳健、可扩展且用户友好的工具，为设计下一代菌株以革新植物转化和推进植物合成生物学应用铺平道路。
该研究聚焦根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）基因组工程。根癌农杆菌是革兰阴性植物病原菌，可通过Ti（tumour-inducing）质粒将转移DNA（transfer DNA, T-DNA）导入植物细胞并整合，其IV型分泌系统（Type IV secretion system, T4SS）介导跨界DNA转移。该能力使其成为植物和真菌遗传转化的重要工具。然而，实验室菌株在过去四十年中遗传优化有限。传统等位基因替换依赖双交换同源重组（homologous recombination, HR）和SacB反向筛选，耗时长、劳动密集且回收低；转座子插入突变随机且筛选低效。CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）革新了细菌基因组工程，已有胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）和INTEGRATE（INsertion of Transposable Elements by Guide RNA–Assisted TargEting）系统，但CBE受突变类型、PAM序列和脱靶限制，INTEGRATE会留下疤痕且整合货物可能再利用时被再移动。λ Red重组工程系统在其他细菌中与CRISPR/Cas9耦合可实现无痕编辑，但在内源HR能力低的根癌农杆菌中尚不清楚。该研究开发并优化λ Red重组酶辅助CRISPR/Cas9系统，实现染色体和Ti质粒多类型编辑。论文发表在《Plant Biotechnology Journal》。
关键技术与方法：研究人员构建双质粒系统，pRi-Cas9-Red-SacB含低拷贝pRi-repABC复制起点、P
AGRO1驱动SpCas9、aTc诱导λ Red操纵子和SacB；pBBR1-SG-Donor-SacB含sgRNA、同源臂（HA）修复模板和SacB。改进质粒pRi-Cas9-Red-SacB-lacIsg加入IPTG诱导靶向pBBR1 Rep基因的sgRNA，用于连续编辑。A. tumefaciens GV3101、EHA105和LBA4404购自商业公司（WEIDI，上海）；E. coli DH5α和DB3.1为克隆宿主；植物材料包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）。通过电穿孔转化、PCR筛选和Sanger测序验证，全基因组测序评估脱靶，AGROBEST拟南芥幼苗瞬时表达及本氏烟草注射瞬时表达检测GUS、RUBY和GFP。
2.1 根癌农杆菌内源同源重组能力不足以修复致死性DSB。研究人员构建pRi-repABC、pVS1和pBBR1三种复制起点的Cas9载体，发现高拷贝pBBR1-Cas9抑制生长；低拷贝pRi-Cas9-SG靶向thyA时无 colonies，空质粒有菌苔，说明单拷贝Cas9可高效切割。Cas9与供体共转后出现菌落，但PCR无thyA缺失，说明EHA105内源HR不足以直接修复CRISPR/Cas9造成的致死性双链断裂（double-strand break, DSB）。
2.2 在根癌农杆菌EHA105菌株中建立λ Red重组酶辅助CRISPR/Cas9系统。aTc诱导λ Red后thyA缺失频率和菌落数显著提高，Sanger测序确认缺失，thyA突变体表现胸苷营养缺陷。HA长度评估显示300 bp足以稳健编辑，50/100 bp较低，500–1000 bp仅略优。删除RecA、AmpC、MutS、MutL和Xse效率为26.7%–86.7%。线性PCR供体效率仅6.7%。rpoB L536H和SSB M181F点突变达100%；10%蔗糖经SacB固化质粒；rpoB突变恢复利福平敏感；RecA大片段替换为apramycin抗性基因效率60%。系统可引入多种突变类型。
2.3 用于连续基因编辑的改良双质粒系统。研究人员构建pRi-Cas9-Red-SacB-lacIsg，通过IPTG诱导靶向pBBR1 Rep的sgRNA，在编辑周期之间消除pBBR1-SG-Donor-SacB。thyA和AmpC位点效率与原始系统相当。先删除RecA，再在RecA突变背景中删除thyA和tetR，效率分别为93.7%和80%。结果表明可迭代编辑，且DSB修复依赖外源λ Red而非内源RecA通路。
2.4 工程改造根癌农杆菌GV3101菌株。将GV3101 rpoB R523Q回复为野生型，效率100%，编辑克隆恢复利福平敏感；删除thyA、RecA、Xse和AmpC效率40%–80%；连续编辑中先删strB，再删RecA和thyA，各40%。在LBA4404中，RecA删除无aTc时无事件，aTc诱导后73.3%；thyA删除80%，Sanger确认thyA
?胸苷依赖；连续编辑RecA后thyA效率73.3%。说明系统跨菌株适用。
2.5 在不同根癌农杆菌菌株中工程改造Ti质粒。将EHA105 pTiBo542 T-DNA左边界及下游1.74 kb替换为gentamycin抗性盒，效率100%，植物转化效率与野生型无显著差异。在GV3101 pMP90中编辑VirD2，N端插入3xHA和GFP11、C端删除omega结构域，效率分别为93.3%和100%。表明系统可高效编辑Ti质粒。
2.6 全基因组测序揭示低脱靶编辑。对2个野生EHA105和12个编辑克隆进行全基因组测序。实验室EHA105相对参考基因组有4个SNP；排除背景后，两个rpoB编辑克隆无脱靶，其他克隆仅1–2个SNP，四个克隆各1个indel；突变位点与sgRNA spacer序列不同，提示sgRNA非依赖，且无碱基替换偏好。系统高度特异、脱靶极低。
2.7 工程改造抗生素敏感根癌农杆菌菌株。EHA105和GV3101固有抗利福平、β-内酰胺、氯霉素和链霉素。研究人员靶向MltB3以废除β-内酰胺抗性，并依次删除tetR、strB、cat和MltB3，获得EHA105-S。该四突变体对四类抗生素敏感，生长曲线与野生型无差别，RUBY和GFP在本氏烟草中瞬时表达无显著差异。说明删除这些抗性基因未损害生长和转化效率。
2.8 工程改造根癌农杆菌EF-Tu基因以增强拟南芥中瞬时基因表达。EF-Tu的elf18表位被Brassicaceae植物EFR识别，限制转化。研究人员将tufA和tufB的N端elf18替换为Pst DC3000 EF-Tu序列，获得单突变和双突变。单突变生长类似野生型，双突变生长缺陷。3天龄拟南芥幼苗GUS瞬时表达中，单突变显著高于野生型，双突变更高；本氏烟草无EFR直系同源物，各菌株GUS无显著差异。说明工程EF-Tu可增强拟南芥瞬时表达。
讨论部分指出，植物遗传转化是植物基因工程瓶颈，根癌农杆菌是最重要载体；传统HR工程耗时低效。该研究将λ Red与CRISPR/Cas9耦合，实现高效、精准、无痕的多类型编辑。EHA105-S作为抗生素敏感底盘有合成生物学价值；EF-Tu工程化菌株有望促进Brassicaceae作物转化。与CBE和INTEGRATE相比，该系统克服突变类型受限、PAM限制、疤痕和货物再移动等问题。RecA突变背景仍高效，适用于AGL1等RecA缺陷菌株。线性供体效率低，HA至少100 bp、300 bp足够，机制待阐明。逃逸克隆可能源于sgRNA或Cas9质粒突变或缺失，具体因素待研究。未来可挖掘农杆菌噬菌体重组酶提高效率。研究结论翻译：研究人员成功开发了λ Red重组酶辅助CRISPR/Cas9基因组编辑系统，可在不同根癌农杆菌菌株的染色体和Ti质粒中精确引入多样突变。该平台可加速根癌农杆菌基因功能分析，并有望开发优化菌株以提高植物转化效率并促进植物合成生物学应用。
