胡椒（Piper nigrum L.）果实乙醇提取物通过钙通道阻断诱导内皮非依赖性血管舒张并抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移

《Journal of Functional Foods》：Ethanol extract of Piper nigrum L. fruit induces endothelium-independent vasorelaxation via calcium channel blockade and suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and migration

　　

胡椒（Piper nigrum L.）果实乙醇提取物（PNE）诱导大鼠主动脉环中强效的内皮非依赖性血管舒张。胡椒碱（piperine）参与PNE的血管舒张活性。PNE抑制细胞外Ca²⁺依赖性血管收缩。PNE和胡椒碱减弱血管紧张素II（Ang II）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化。PNE和胡椒碱抑制Ang II诱导的VSMCs增殖和迁移反应。

研究背景：血管系统是器官与调节网络间的中心界面，其功能依赖血管结构与功能完整，以维持血流、组织灌注和代谢交换。血管稳态由内皮细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）协同维持。内皮细胞释放一氧化氮、前列环素和内皮源性超极化因子调节血管张力；VSMCs响应机械和体液刺激，包括膜去极化、Ca²⁺内流和血管活性物质如血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）。在VSMCs中，膜去极化激活电压依赖性Ca²⁺通道，受体刺激激活受体操纵性Ca²⁺进入通路，二者升高胞内Ca²⁺并引发收缩；K⁺通道调节膜电位并由此调节Ca²⁺内流。病理条件下，VSMCs由分化静息表型向合成表型转换，增殖、迁移和细胞外基质产生驱动血管重塑、动脉硬化和血管反应性受损。Ang II通过AT₁受体依赖信号增强胞内Ca²⁺动员，促进血管收缩和VSMC表型转换。同时靶向血管张力调节和结构重塑可能更有效，但少有药物在统一实验框架中系统评价双重作用，天然多靶点化合物因此受到关注。胡椒（Piper nigrum L.，PN）果实传统作为调味香料，具有抗氧化、抗炎、代谢调节和心血管保护作用，主要活性成分为胡椒碱。胡椒碱有血管舒张和抑制血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）刺激VSMC增殖的报道，PN也与抗高血压和血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制活性相关。但PN提取物直接血管效应，尤其对Ang II诱导血管收缩和VSMC活化及Ca²⁺依赖信号，仍不充分。因此，研究人员研究PN乙醇提取物和胡椒碱是否发挥血管舒张并调节与血管重塑相关的VSMC反应。研究人员用离体大鼠主动脉环评价血管舒张，机制分析聚焦内皮非依赖、细胞外Ca²⁺依赖收缩、K⁺通道参与和Ang II诱导收缩抑制；在Ang II刺激VSMCs中评估钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）磷酸化、增殖和迁移。结论：PNE诱导内皮非依赖性血管舒张，抑制细胞外Ca²⁺依赖收缩；PNE和胡椒碱减弱Ang II诱导CaMKII磷酸化，抑制Ang II诱导增殖和迁移；PNE活性强于PNW，与胡椒碱含量高一致。意义：支持PN调节血管张力和VSMC活化，提示其作为血管健康功能食品资源的潜力。

关键技术方法：采用离体大鼠主动脉环张力测定，比较内皮完整与去除环；无Ca²⁺ KH缓冲液加EGTA后，以PE或KCl激活受体操纵性钙通道（receptor-operated calcium channels，ROCCs）或电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channels，VDCCs），再累积加入CaCl₂；用BaCl₂、4-AP、TEA、glibenclamide评估K⁺通道；以Ang II诱导收缩。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）定量胡椒碱。VSMCs来自SD大鼠胸主动脉，经α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）鉴定；用WST/EZ-CYTOX测活力与Ang II诱导增殖，蛋白免疫印迹测p-CaMKII/CaMKII，伤口愈合与Transwell实验测迁移。PN干燥果实来源越南，购自Donguiherb；大鼠为雄性SD大鼠，来自Daehan Biolink。

研究结果：
3.1 Quantitative analysis of Piperine in PNE and PNW：HPLC分析显示胡椒碱保留时间为18.7 min，PNE中含量为28.0%，PNW中含量为2.5%。
3.2 Vasodilatory effect of PNE, PNW, and Piperine：在PE预收缩主动脉环中，PNE从50 μg/mL起显著舒张，500 μg/mL最大舒张为98.8±1.5%，EC₅₀为119.9 μg/mL；PNW无显著浓度依赖反应，EC₅₀无法确定；胡椒碱从10 μg/mL起显著舒张，100 μg/mL最大舒张为99.1±1.1%，EC₅₀为19.3 μg/mL。
3.3 Endothelium Independence of PNE-induced Vasorelaxation：PNE在内皮完整和内皮去除环中均浓度依赖舒张，最大舒张分别为94.6±2.2%和98.3±1.2%，无显著差异，提示内皮非依赖性。
3.4 Inhibitory effect of PNE on extracellular CaCl₂-induced contraction：PNE显著抑制PE预处理后CaCl₂诱导的收缩，100、200、500 μg/mL使最大张力降至51.0±8.8%、?3.9±6.9%、?10.8±3.9%；在KCl去极化环中降至25.3±9.2%、?5.7±2.3%、?5.7±2.3%。
3.5 Effects of Potassium Channel blockers on PNE-induced Vasorelaxation：BaCl₂、TEA和glibenclamide不影响PNE最大舒张；4-AP在100和200 μg/mL部分减弱舒张（24.9±8.2% vs 42.2±7.5%；66.1±6.1% vs 89.5±4.6%），但不影响最大舒张，且不呈一致浓度依赖。
3.6 Inhibitory effect of PNE on Ang II-induced contraction：Ang II诱导浓度依赖收缩，PNE预处理显著抑制；抑制10^?7 M Ang II诱导收缩的EC₅₀估计为163.4 μg/mL，95%置信区间为67.1–398.1 μg/mL，R²=0.6487，曲线拟合置信有限。
3.7 Effects of PNE and piperine on VSMC viability and Ang II-induced proliferative response：PNE≤100 μg/mL、胡椒碱≤30 μM不显著降低活力；PNE 300 μg/mL使活力降至7.7±1.6%。Ang II使增殖反应升至176.2±6.9%；PNE 10、30、100 μg/mL使其降至112.1±4.4%、97.5±8.0%、18.4±1.3%；胡椒碱1、3、10 μM使其降至147.0±4.5%、131.1±3.6%、110.9±6.3%。
3.8 Effects of PNE and piperine on Ang II-induced CaMKII phosphorylation：Ang II使p-CaMKII/CaMKII比值升至2.08倍；PNE 10和30 μg/mL使其降至0.87和0.98倍。胡椒碱实验中Ang II使比值升至1.51倍；胡椒碱1和3 μM使其降至1.13和1.06倍，3 μM时显著降低。
3.9 Inhibitory effects of PNE and piperine on Ang II-induced migration of VSMCs：伤口愈合实验中Ang II使相对闭合率升至1.51±0.24，PNE 10、30 μg/mL使其降至1.04±0.09、0.94±0.12；胡椒碱1、3 μM使其降至1.03±0.04、0.95±0.03。Transwell实验中Ang II使相对迁移率升至2.28±0.10，PNE使其降至1.19±0.11、1.12±0.11；胡椒碱使其降至1.29±0.05、0.94±0.08。

讨论部分总结：讨论认为，本研究在一个实验框架内整合血管张力调节与VSMC活化，Ang II作为病理刺激。PNE浓度依赖舒张而PNW无效，与PNE较高胡椒碱含量一致。胡椒碱EC₅₀低于PNE，提示提取物活性不能完全由单一成分解释，其他植物化学成分的贡献不能排除。内皮完整与去除无差异支持内皮非依赖机制。PNE抑制ROCCs和VDCCs介导的细胞外Ca²⁺内流相关收缩。K⁺通道阻滞剂结果不支持K⁺通道为主要机制，4-AP中间浓度效应仅为初步证据。PNE抑制Ang II诱导收缩，但EC₅₀拟合精度有限。分子上，PNE和胡椒碱降低Ang II诱导CaMKII磷酸化，但未直接测胞内Ca²⁺动态和特定钙通道。非细胞毒性浓度下，二者抑制Ang II诱导增殖和迁移，但WST不能区分细胞静止与细胞毒性，迁移机制未明，需进一步研究。局限包括仅用雄性大鼠，性别差异未评估。

研究结论翻译：总体而言，本研究表明PNE具有强效内皮非依赖性血管舒张作用，功能上与抑制细胞外Ca²⁺依赖性收缩相关；PNE及其主要成分胡椒碱减弱Ang II诱导的VSMCs中CaMKII磷酸化，并在非细胞毒性浓度下降低Ang II诱导的增殖和迁移反应，提示其调节血管张力和VSMC活化的潜力；PNE血管活性强于PNW，与其显著更高的胡椒碱含量一致。鉴于PN的广泛膳食使用，这些发现支持其作为血管健康功能食品资源的潜力。然而，Ca²⁺相关效应背后的精确上游分子靶点仍需通过钙成像、电生理方法和特定钙通道蛋白分析等进一步研究阐明，并需进一步体内研究评估血压调节、血管壁重塑以及全身疗效和安全性。