辣木（Moringa oleifera Lam.）叶新型锌螯合肽：结构特征及其对乙醇诱导AML-12肝细胞损伤的肝保护作用

《Journal of Functional Foods》：Novel zinc-chelating peptides from Moringa oleifera lam. leaves: Structural characteristics and hepatoprotective effects against ethanol-induced injury in AML-12 cells

　　

研究人员成功从辣木（Moringa oleifera Lam.）叶中合成新型锌螯合肽。鉴定羧基/羰基氧（carboxyl/carbonyl oxygen）为肽中主要锌结合位点。肽-锌螯合物（peptide-zinc chelates）显著增强肝细胞（hepatocytes）的细胞锌摄取（cellular zinc uptake）。螯合物（chelates）对乙醇（ethanol）诱导的氧化性细胞损伤（oxidative cell damage）具有强效保护作用。

研究背景：辣木（Moringa oleifera Lam.）叶（Moringa oleifera Lam. leaves，MOLL）富含蛋白质、维生素、矿物质和生物活性成分，蛋白质约占干物质25%，氨基酸组成较平衡，并已被批准为新食品。既往研究表明，MOLL经Alcalase水解产生的肽在化学和细胞模型中具有抗氧化活性，研究已从粗水解物活性评价转向特定功能序列鉴定。但金属螯合对MOLL肽结构和生物活性的影响仍需进一步研究。氧化应激是酒精相关性肝损伤的重要促进因素；乙醇代谢扰乱肝脏氧化还原稳态，其中CYP2E1（cytochrome P450 2E1，细胞色素P450 2E1）介导的乙醇氧化是活性氧（reactive oxygen species，ROS）、脂质过氧化和肝细胞损伤的重要来源。Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）–Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）系统调控内源性抗氧化防御，CYP2E1和Keap1分别代表ROS生成和抗氧化防御两个互补靶点。锌是必需微量元素，参与细胞氧化还原调节。MOLL肽钙螯合物可促进钙转运和利用，且MOLL来源二肽和三肽可能具有Zn²⁺螯合潜力。现有工作主要集中于功能肽鉴定或矿物质补充。因此，研究人员假设不同MOLL肽序列与Zn²⁺形成不同配位结构，进而影响胞内锌可利用性和抗乙醇氧化应激保护。研究目的为：分级MOLL蛋白水解物，以LC-MS/MS鉴定肽并针对CYP2E1和Keap1筛选候选肽；用光谱、分子对接和分子动力学研究所选肽-锌复合物的Zn²⁺结合位点、结构变化和构象特征；在乙醇损伤AML-12细胞中评价胞内锌可利用性和保护作用。该研究旨在阐明肽序列和Zn²⁺配位如何影响细胞活性，为开发具有肝保护潜力的MOLL来源锌螯合肽提供依据。

研究人员开展了上述三部分研究，得出HDYLTGGF和EYF为MOLL来源可形成稳定Zn²⁺螯合物的肽，主要经含氧羧基/羰基配位；两复合物呈现不同结构–功能特征；二者均可减轻乙醇诱导的AML-12细胞氧化损伤。其意义在于提示Zn²⁺配位可依肽序列和构象差异影响锌可利用性和肽介导生物活性。

关键技术方法：所用MOLL干粉购自Honghegu Moringa Co., Ltd.（Honghe, China），AML-12细胞购自Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.（Wuhan, China），纯肽由Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd.合成。MOLL蛋白经碱溶酸沉提取和超声或微波预处理后，采用两步酶解制备水解物，并经10、3、1 kDa超滤分级。以LC-MS/MS鉴定<1 kDa组分肽序列，结合分子对接针对CYP2E1（PDB ID: 3E6I）和Keap1（PDB ID: 2FLU）筛选候选肽。纯肽用于制备肽-锌螯合物，以EDTA滴定测定锌螯合能力。采用SEM-EDS、UV-vis、FT-IR、DLS和Zeta电位进行结构表征；以AutoDock分子对接和Desmond 200 ns分子动力学模拟解析Zn²⁺配位；在AML-12细胞中建立200 mmol/L乙醇损伤模型，以MTT、Zinpyr-1、DCFH-DA、Hoechst 33342及AST、ALT、GSH、MDA、SOD、CAT评价保护作用。

研究结果：
3.1 MOLL蛋白水解度测定：通过超声或微波预处理后单酶及两步酶解比较水解度（degree of hydrolysis，DH），发现超声预处理显著提高水解效率，超声+Alcalase最高DH为26.63±2.51%；Alcalase后Flavourzyme两步水解DH达33.77±0.27%，为Alcalase单独的1.27倍，说明可释放更多小分子肽。
3.2 不同分子量MOLL水解物组分的体外活性：通过超滤得到<1、1–3、3–10、>10 kDa四个组分并测肽含量、DPPH、ABTS、FRAP和ADH活化。随截留分子量降低，肽含量降低；<1 kDa在DPPH和ABTS清除中最强，分别为35.79±0.90和62.82±2.46 mmol Trolox/g，显著优于其他组分；FRAP无显著差异；1–3 kDa的ADH活化最高27.88±2.87%，与<1 kDa的25.50±1.52%无显著差异。因此<1 kDa因综合抗氧化能力和潜在ADH活化被选后续。
3.3 通过分子对接筛选活性肽：LC-MS/MS从<1 kDa鉴定9044条序列；选Score前30及富含Tyr、Gly、Glu、Phe、His、Gln的20条共50条，与Keap1和CYP2E1对接。EYF总结合能最低?18.0 kcal/mol；HDYLTGGF得分和峰面积最高，且与Keap1结合能最低?10.0 kcal/mol。二者与靶蛋白形成氢键、盐桥、π-π堆积和疏水接触。选HDYLTGGF和EYF制备锌螯合物，锌螯合能力分别为89.14±2.88和114.10±4.39 mg/g。
3.4 肽-锌螯合物结构表征
3.4.1 SEM：HDYLTGGF为絮状，螯合Zn²⁺后变为晶体伴少量球形晶体；EYF为层状，螯合后表面凹陷皱褶、粗糙度增加但连续性增强。EDS显示螯合后出现Zn信号，Zn原子分数为27.21%和32.16%，氧增加而碳氮降低，提示Zn²⁺与含氧基团结合。
3.4.2 UV-Vis：两肽在242 nm有最大吸收，螯合后蓝移至239 nm且吸光度降低；EYF-Zn降低更明显，说明Zn²⁺与羰基氧、羧基氧或羟基配位改变发色团电子环境，且EYF螯合更强。
3.4.3 FT-IR：螯合后3300 cm^?1附近OH伸缩振动峰强度降低；酰胺I带HDYLTGGF红移1662至1645 cm^?1，EYF蓝移1631至1629 cm^?1；酰胺II带减弱；约1100 cm^?1侧链羧基峰移向高波数。二级结构拟合显示β-折叠分别增加34%和28%，α-螺旋降至9%和14%，β-转角降低6%和4%，无规卷曲降至19%和11%。说明羟基、羧基氧、羰基氧参与配位，形成更有序多齿配位网络。
3.4.4 粒径和Zeta电位：DLS显示HDYLTGGF为215.73±3.43 nm（PDI=0.295），EYF为198.40±3.55 nm（PDI=0.253）；螯合后分别增至530.03±6.80 nm和450.73±6.97 nm，PDI降低，提示Zn²⁺交联并稳定结构。Zeta电位由6.35±0.21和3.71±0.34 mV变为?10.31±0.75和?5.06±0.50 mV，证实螯合物成功合成。
3.5 Zn²⁺配位位点预测和分子动力学
3.5.1 分子对接：HDYLTGGF与Zn²⁺结合能为?3.65 kcal/mol，EYF为?4.26 kcal/mol。HDYLTGGF中Zn²⁺主要与ASP2羧基和GLY7羰基配位，距离为2.1、2.2、3.7 ?；EYF中Zn²⁺与PHE3末端羧基和TYR2酚羟基发生短程静电作用，距离短、结合强。
3.5.2 分子动力学：200 ns模拟显示两肽均可与Zn²⁺形成稳定复合物，配位区呈负静电势。HDYLTGGF主要通过原子26和27配位，平均距离约2.3 ?且波动小；EYF距离约2.1 ?更短。HDYLTGGF的RMSD前20 ns由2 ?升至4–6 ?后平衡，表明构象重排；EYF的RMSD快速稳定约2 ?。Rg显示HDYLTGGF-Zn在6–8 ?波动并瞬时可扩至10–11 ?，EYF-Zn稳定约4.5 ?，更紧凑刚性。RMSF显示HDYLTGGF配位核心受抑制而末端灵活，EYF整体柔性较低、核心稳定。因此EYF-Zn更紧凑刚性且Zn保留可能更强，HDYLTGGF-Zn构象适应性更强，可能保留功能残基可及性。原文提示胞内蛋白和内源配体竞争可能改变配位平衡，导致部分Zn²⁺交换或解离。
3.6 肽-锌螯合物对AML-12细胞乙醇诱导氧化损伤的保护作用
3.6.1 细胞保护作用：200 mmol/L乙醇使细胞活力约70%，建立模型。100 μg/mL HDYLTGGF、EYF或ZnSO₄单独无显著毒性，但100 μg/mL HDYLTGGF-Zn和EYF-Zn显著降低细胞活力，故选50 μg/mL。保护实验中，所有处理降低乙醇损伤；水飞蓟素（silymarin）正对照细胞活力为92.34±4.93%；HDYLTGGF和EYF分别为83.31±6.93%和80.67±6.11%；螯合后分别提高1.08倍和1.12倍。等质量给药下螯合物优于对应肽。AST和ALT在模型组显著升高，除ZnSO₄外各处理显著降低。
3.6.2 肽-Zn处理后胞内Zn²⁺可利用性：用Zinpyr-1和Hoechst 33342成像，3、6、12 h胞内Zn²⁺荧光随时间增加，12 h最高；ZnSO₄、HDYLTGGF-Zn、EYF-Zn荧光强度分别为13.95±2.13、22.53±5.65、30.91±8.97，肽-Zn螯合物高于ZnSO₄，EYF-Zn更强。Zinpyr-1检测胞内不稳定Zn²⁺而非完整复合物，提示至少部分Zn在细胞暴露后可交换，符合部分配体交换或Zn²⁺再分布。
3.6.3 ROS水平检测：DCFH-DA和Hoechst 33342显示模型组绿色荧光增至1.87倍，证实乙醇诱导ROS。各处理降低荧光；水飞蓟素最强降至0.87±0.17，HDYLTGGF和EYF单独也显著抑制ROS；螯合物比对应肽进一步降低，说明抗氧化肽、Zn²⁺可利用性改变及配位诱导结构变化共同作用。
3.6.4 氧化应激相关指标：模型组MDA升至44.34 nmol/mg prot，SOD、CAT、GSH分别降至118.20 U/mg prot、4.96 U/mg prot、54.73 μmol/g prot。水飞蓟素逆转，ZnSO₄无显著差异。HDYLTGGF使MDA降低15.27 nmol/mg prot，SOD、CAT、GSH分别增加97.18 U/mg prot、6.58 U/mg prot、51.41 μmol/g prot；EYF使MDA降低12.20 nmol/mg prot，SOD、CAT、GSH分别增加111.01 U/mg prot、3.93 U/mg prot、53.37 μmol/g prot。螯合物在等剂量下优于对应肽。原文认为SOD、CAT、GSH恢复可能与Keap1–Nrf2通路相关；对接显示EYF与Keap1的Arg415、Arg483、Tyr572作用，HDYLTGGF与Tyr572作用，这些残基参与Keap1与Nrf2结合；但需验证Nrf2核转位及HO-1、NQO1等下游效应蛋白。HDYLTGGF和HDYLTGGF-Zn在多数指标优于EYF和EYF-Zn，原文提出可能与His、Tyr、Phe、Leu等多氨基酸协同和构象可及性有关；紧凑刚性EYF-Zn更关联Zn²⁺递送，柔性且残基多样的HDYLTGGF-Zn更强肽介导抗氧化。

讨论部分总结：该研究提示Zn²⁺配位依肽序列和构象差异影响锌可利用性和肽介导生物活性。EYF-Zn更紧凑刚性、锌含量高、胞内不稳定Zn²⁺信号更强；HDYLTGGF-Zn构象更灵活，在多数细胞终点抗氧化和肝保护更强。两者均改善细胞活力、降低ROS和MDA、恢复SOD和CAT活性及GSH。基于体外肝细胞模型，不能直接外推体内；CYP2E1和Keap1–Nrf2参与基于对接和抗氧化表型，未在蛋白水平直接验证。未来应在等摩尔Zn²⁺条件比较，阐明胞内配位状态和相对螯合活性，验证CYP2E1和Keap1–Nrf2信号，并在动物酒精性肝损伤模型中评价功效和安全性。

研究结论翻译：本研究鉴定HDYLTGGF和EYF为MOLL来源肽，能够主要经含氧羧基/羰基形成稳定Zn²⁺螯合物。两种复合物表现出不同的结构–功能特征。EYF-Zn形成更紧凑、刚性的配位结构，锌含量更高，并产生更强的胞内不稳定Zn²⁺信号；而HDYLTGGF-Zn保留更大构象灵活性，并在多数细胞终点表现出更强抗氧化和肝保护作用。两种螯合物均通过提高细胞活力、降低ROS和MDA水平、恢复SOD和CAT活性及GSH含量，减轻乙醇诱导的AML-12细胞氧化损伤。这些发现表明，Zn²⁺配位可依肽序列和构象差异影响Zn²⁺可利用性和肽介导生物活性。本研究基于体外肝细胞模型，不能直接外推至体内功效。此外，所提出的CYP2E1和Keap1–Nrf2信号参与由分子对接和抗氧化表型支持，但尚未在蛋白水平直接验证。未来研究应在等摩尔Zn²⁺条件下比较这些螯合物，阐明其胞内配位状态和相对螯合活性，验证CYP2E1活性和Keap1–Nrf2信号，并进一步在已建立的酒精相关性肝损伤动物模型中评价其保护功效和安全性。这些研究将有助于确定MOLL来源肽–Zn复合物能否开发为用于膳食管理酒精相关性肝氧化应激的功能成分。