发酵乳杆菌K73合生制剂调节自闭症谱系障碍儿童粪菌移植小鼠的肠道菌群功能与行为

《Journal of Functional Foods》：Limosilactobacillus fermentum K73 synbiotic modulates gut microbiota function and behavior in gnotobiotic mice transplanted with microbiota from children diagnosed with autism spectrum disorder

　　

摘要专业翻译 针对肠道菌群失调的膳食策略正逐渐成为疾病治疗的新兴方案。神经典型发育患者与自闭症患者的肠道菌群组成存在显著差异。合生制剂（synbiotic）处理可安全地改变人源化无菌小鼠（gnotobiotic mice）的肠道菌群。本研究将拉丁美洲人群中的肠道菌群代谢与行为联系起来。

论文解读文章

研究背景与科学问题

近年来，通过膳食干预恢复肠道菌群失衡已成为多种病理状态的治疗新方向。其中，合生制剂（synbiotic，益生菌与可发酵益生元的混合物）因其组分间的协同效应而备受关注。临床研究已初步证实合生制剂对自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）患儿肠道菌群的调节作用。然而，现有益生菌配方多忽视人类肠道微生物组的生态复杂性，且全球微生物组研究高度集中于高收入国家，拉丁美洲人群的数据严重缺失。此外，ASD患者常伴有感官刺激异常导致的饮食选择性、肠道菌群失调以及短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）和神经递质等代谢物谱的改变，亟需针对特定人群的靶向干预策略。

研究设计与主要结论

为评估发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）K73合生制剂的体内调节效果，研究人员从哥伦比亚招募了7名ASD确诊患儿和18名年龄性别匹配的神经典型（neurotypical，NT）对照儿童，采集其粪便样本。通过16S rRNA测序确认两组儿童的肠道菌群组成存在显著差异后，选取代表性样本用于无菌小鼠（gnotobiotic mice）的人源化定植。研究人员首先在野生型小鼠中验证了合生制剂的安全性及粉末状给药途径的优越性，随后对定植有人源菌群的小鼠进行为期21天的合生制剂干预。结果表明，合生制剂处理不仅提升了有益菌群的丰度，还特异性地增加了ASD菌群定植小鼠的SCFAs（尤其是丁酸和乙酸）产生，同时降低了粪便血清素水平。更重要的是，行为学测试显示，合生制剂改善了ASD菌群定植小鼠的社交行为、探索行为和重复刻板行为，且这些行为变化与特定的SCFA浓度存在相关性。

关键技术与方法

1. 1.
   粪菌移植与无菌小鼠模型：使用来自哥伦比亚ASD患儿和NT对照儿童的粪便样本，通过灌胃方式定植于C57BL/6品系的无菌雄性小鼠，建立人源化无菌小鼠模型。
2. 2.
   16S rRNA基因扩增子测序：对V3-V4区域进行测序，分析人类供体及小鼠不同时间点粪便样本的菌群组成、α多样性和β多样性。
3. 3.
   短链脂肪酸定量：采用高效液相色谱法（HPLC-DAD）测定粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。
4. 4.
   血清素检测：使用商业化ELISA试剂盒定量粪便和血清中的血清素浓度。
5. 5.
   行为学测试：通过旷场实验（open field test）、大理石掩埋实验（marble burying test）和三箱社交实验（three-chamber test）评估小鼠的探索、重复及社交行为。

研究结果

3.1 哥伦比亚ASD与非ASD儿童肠道菌群特征

通过16S rRNA测序分析发现，ASD患儿的α多样性（observed features和Chao1指数）显著低于NT对照组。β多样性分析显示两组菌群结构存在显著差异。差异分析鉴定出45个显著不同的ASV（amplicon sequence variants），其中ASD样本中Bacteroides、Bifidobacterium、Blautia、Butyrococcus和Ruminococcus属丰度降低，而Butyricimonas、Collinisella、Dorea、Holdemanella、Phascolarctobacterium、Sarcina及Prevotella7和9属丰度升高。

3.2 成功构建人源化无菌小鼠模型

将选定的供体粪便悬液灌胃给无菌小鼠后，约52%-59%的ASV源自对应供体，且这些供体来源微生物占小鼠总菌群相对丰度的75%-99%。尽管α多样性在定植过程中下降，但β多样性分析显示小鼠仍按供体ASD/NT状态聚类。差异分析表明，定植小鼠中Prevotella9、Butyricicoccus和Holdemanella在ASD组增加，而Bifidobacterium、Faecalibacterium和Akkermansia减少，与供体菌群特征一致。

3.3 合生制剂在野生型小鼠中的安全性与递送优化

所有处理组小鼠体重、食物摄入量及结肠组织学均无显著差异，证明合生制剂安全性良好。菌群分析显示，粉末状合生制剂（SynPowder）比面包状合生制剂更能促进产丁酸的Enterohabdus属和Clostridium UCG002群等有益微生物增殖，因此被选为人源化小鼠研究的给药方式。

3.4 合生制剂改变人源化小鼠肠道菌群组成

合生制剂处理21天后，两组小鼠的α多样性（Shannon指数）均显著增加。尽管β多样性未显示全局性改变，但每只小鼠的个体PCA图均显示出处理前后的明显分离。差异分析发现，合生制剂在所有小鼠中降低了Escherichia-Shigella和Eggerthellaceae等潜在致病菌的丰度，并在ASD组中特异性地减少了Enterococcus和Bacteroides。同时，Faecalibacterium、Sellimonas和Collinsela等产丁酸菌的丰度增加。PCR检测证实了L. fermentum K73的胆汁盐水解酶基因的存在。

3.5 合生制剂改善ASD菌群定植小鼠的代谢功能

SCFA定量结果显示，两组小鼠的粪便丁酸水平在处理期间均显著上升，这与产丁酸菌的增加相一致。乙酸仅在ASD菌群定植小鼠中出现短暂但显著的升高。丙酸在NT组中显著下降，ASD组则无变化。进一步分析表明，合生制剂促进了丁酸和乙酸的生成。重要的是，ASD菌群定植小鼠的粪便血清素水平从处理前的8.4 ± 3.5 nM/mg显著下降至处理后的5.0 ± 1.4 nM/mg，而NT组无显著变化。

3.6 合生制剂改变ASD菌群定植小鼠的社会与探索行为

旷场实验中，合生制剂处理后仅ASD菌群定植小鼠的总探索距离显著减少。中心/外周时间比在NT组中下降，而在ASD组中保持稳定。三箱社交实验显示，合生制剂处理显著增加了ASD菌群定植小鼠的社交时间。大理石掩埋实验中，ASD菌群定植小鼠在合生制剂处理后掩埋的大理石数量从平均2.4个显著增加至5.3个，几乎翻倍。Spearman相关性分析揭示，乙酸产量与ASD菌群定植小鼠的社交能力呈强正相关（r=0.65），而丙酸与两组小鼠的掩埋行为均呈负相关。

讨论与结论总结

研究表明，发酵乳杆菌K73合生制剂能够有效调节人源化无菌小鼠的肠道菌群，特别是在ASD菌群定植的小鼠中，增加了有益菌群并改变了关键代谢物（SCFAs和血清素）的产生。这些代谢变化伴随着ASD相关行为的改善，如社交行为增强和重复行为减少。该研究首次成功将哥伦比亚儿童的肠道菌群定植到无菌小鼠中，为拉丁美洲人群的微生物组研究提供了重要的临床前平台。研究结论指出，靶向合生制剂作为一种潜在策略，有望改善健康及疾病状态下的肠道微生物组功能，并为未来的人类应用提供了安全性和转化潜力的证据。