椎间盘退变治疗通用微凝胶平台：靶向周细胞介导纤维化并保护髓核细胞的多功能递送系统

《Advanced Science》：Versatile Microgel Platform for Intervertebral Disc Degeneration Therapy: Targeting Pericyte-Mediated Fibrosis and Protecting Nucleus Pulposus Cells

纤维化既是椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）的结果，也是其驱动因素；然而，纤维化成效细胞（fibrotic effector cells）的起源、通路与调控机制仍不完全清楚，导致抗纤维化疗法开发受限。在该研究中，研究人员识别出周细胞（pericytes）为IVDD中新型纤维化成效细胞，并通过转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路激活参与纤维化。为此，研究人员构建了微凝胶平台MMS@TRP：将负载miR-21抑制剂、偶联周细胞靶向肽（pericyte-targeting peptide，pPB）的四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acid，tFNA）纳米载体TRP，装载于单宁酸（tannic acid，TA）基金属-酚网络（metal-phenolic network，MPN）功能化的甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）微球（microspheres，MS）上。该微凝胶可保护TRP免受核酸酶降解，并实现pH敏感释放。MMS@TRP早期释放TRP，将miR-21抑制剂靶向递送至周细胞，通过阻断TGF-β信号抑制周细胞增殖、迁移及肌成纤维细胞转化；同时TA持续释放，通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除、线粒体保护和抗炎作用长期保护髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）。综上，MMS@TRP为抑制纤维化并保护NPCs的IVDD治疗提供了通用创新策略。

研究背景方面，腰痛（low back pain，LBP）全球致残首位原因，椎间盘退变（IVDD）是其主因，影像学生存率随年龄显著上升。IVDD表现为驻留细胞丢失、炎症微环境、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解、异常血管化与神经长入，其中病理性纤维化既是结果也是驱动因素。既往研究多关注退变髓核细胞（NPCs）本身作为纤维化成效细胞，也发现巨噬细胞、PDGFA+纤维环细胞等参与，但周细胞（pericytes，附着于微血管基底膜的多潜能间充质样细胞）在IVDD纤维化中的角色长期未被系统证实。由于直接阻断TGF-β1可能干扰健康NPC的ECM稳态，研究人员希望找到更精准的靶点：即周细胞经TGF-β信号向肌成纤维细胞转化这一环节。

研究人员通过开展空间分辨单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据分析、人退变椎间盘组织与大鼠IVDD模型验证、条件培养基共培养、RNA测序、纳米载体与微凝胶构建及表征、体外细胞功能实验以及大鼠穿刺诱导IVDD体内治疗评价，得出结论：周细胞是IVDD中此前被忽视的纤维化成效细胞；退变NPC通过分泌TGFβ1激活周细胞TGF-β/Smad与PI3K-Akt信号，促其增殖、迁移和肌成纤维细胞转化；miR-21上调会抑制Smad7而强化纤维化，因此miR-21抑制剂可上调Smad7、阻断TGF-β信号；MMS@TRP能早期靶向周细胞抗纤维化，并借TA长期保护NPC。该论文发表于《Advanced Science》，意义在于首次把周细胞列为IVDD纤维化效应细胞，并给出“抗纤维化＋保护驻留细胞”双功能局部递送范式，可拓展至其他炎症相关疾病。

主要关键技术方法包括：利用公开空间分辨scRNA-seq数据集（OEP003834）及人轻度/重度退变椎间盘、大鼠IVDD模型做细胞生态与蛋白验证；以TBHP诱导NPC条件培养基模拟退变微环境进行共培养；采用RNA-seq与通路富集分析判定机制；以tFNA偶联pPB构建TRP纳米载体；以TA/Sr²⁺金属-酚网络修饰GelMA微球形成MMS并负载TRP；通过体外释放、酶降解保护、细胞摄取及大鼠椎间盘穿刺模型评价疗效。

研究结果部分，2.1 周细胞作为IVDD中纤维化效应细胞：通过UMAP分群、区域占比定量、免疫荧光RGS5⁺/PDGFRβ⁺染色及大鼠移植实验，研究人员发现退变椎间盘各区域周细胞增多，移植周细胞加重蛋白聚糖丢失、胶原I（Col1）沉积与纤维化重塑，证实其为成效细胞。2.2 退变NPC经TGF-β信号促进周细胞活化与肌成纤维细胞转化：条件培养基实验、RNA-seq、ELISA、Western blot与中和/抑制剂实验显示，dNPC分泌TGFβ1激活经典Smad2/3及非经典PI3K-Akt，促进周细胞迁移、增殖和α-SMA、Col1表达。2.3 miR-21抑制剂通过上调Smad7阻断TGF-β信号抑制周细胞促纤维化转化：预测与转录组交叉锁定miR-21，双荧光素酶证明miR-21结合Smad7 3′-UTR；miR-21抑制剂升Smad7、降p-Smad2/3及α-SMA/Col1，Smad7敲低逆转该效。2.4 周细胞靶向纳米载体TRP构建与表征：PAGE、HPCE、DLS、TEM/AFM确认tFNA载miR-21抑制剂并偶联pPB后粒径由9.7 nm增至17.7 nm；抗PDGFRB抗体阻断实验与多细胞摄取比较证明TRP经PDGFRB介导特异内吞。2.5 MMS@TRP微凝胶系统构建与表征：微流控制备GelMA MS（约150 μm），TA/Sr²⁺ MPN涂层经SEM、FTIR、XPS、元素映射确认；分子对接与PAGE表明TA占据DNase I活性域、保护TRP与miR-21抑制剂免遭核酸酶降解。2.6 MMS@TRP中TRP与TA释放：pH 6.2下24 h释TRP近65%、3 d约85%，TA可持续14 d；体内IVIS显示Cy3-miR-21抑制剂在椎间盘保留超4 d，释放TRP仍保持结构并被PDGFRB⁺周细胞摄取。2.7 MMS@TRP抑制dNPC诱导的周细胞促纤维化行为：Transwell、免疫荧光、Western blot与RNA-seq显示其升Smad7、抑p-Smad2/3、α-SMA、Col1及ECM受体/PI3K-Akt通路。2.8 MMS@TRP通过ROS清除、线粒体保护与抗炎保护NPC：DPPH/PTIO/ABTS、DCFH-DA、MitoSOX、JC-1及qPCR/WB表明TA持续释药清除胞内外ROS、保线粒体膜电位、抑IL-1β/TNF-α、升IL-10，并恢复Acan、Col2合成及抑MMP13、ADAMTS5。2.9 MMS@TRP体内治疗IVDD评价：大鼠穿刺模型椎间盘内注射，X线、MRI、H&E、Safranin O/Fast Green及免疫荧光显示MMS@TRP最优维持椎间盘高度指数（disc height index，DHI）、T2信号、蛋白聚糖，并降Col1与炎症/降解酶。

讨论部分总结：研究人员指出该研究首次将周细胞定义为IVDD病理纤维化驱动细胞，弥补了既往仅聚焦NPC/AF细胞/巨噬细胞的不足；MMS@TRP不是单纯递送小分子，而是把“靶向阻断周细胞TGF-β/Smad转化”和“TA介导抗氧化-线粒体和抗炎保护NPC”集成于单次椎间盘注射平台。TA/Sr²⁺ MPN既延寿核酸载体又响应酸性微环境，Sr²⁺在本配方未致异位钙化。平台对框架核酸（framework nucleic acid，FNA）保护具通用性，可迁延至软骨、肾纤、肺纤等炎症纤维化病。局限在于周细胞迁移轨迹需谱系追踪、机械载荷对微凝胶释药影响未评、TGFβ1并非唯一诱因故联合靶点值得后续探索。

结论翻译：综上，MMS@TRP平台通过抑制周细胞介导的纤维化与保护髓核细胞，提供了一种通用且创新的IVDD缓解策略；该平台同时为框架核酸纳米载体的保护性递送给出可推广方案，并有望用于广泛炎症相关疾病。