基于混合层级理论-微流变（HHM）框架量化动脉粥样硬化疾病进展中的多尺度力学标志物：诊断与风险评估新策略

《Advanced Science》：A Hybrid Hierarchical Framework for Quantifying Mechanical Markers in Atherosclerotic Disease Progression: A New Approach for Diagnosis and Risk Assessment

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础。尽管诊断与治疗取得进展，当前方法主要聚焦晚期干预，错失早期检测的关键机会。近期，动脉组织的动态力学特性已被认为是一种评估血管状态的新方法，并为利用动脉粥样硬化病变的力学特性评估疾病状态与监测疾病进展提供了机会。在此，研究人员采用混合层级理论-微流变（Hybrid Hierarchical theory–Microrheology, HHM）框架量化病变进展期间的多尺度力学标志物。结果揭示了两阶段幂律流变，其中短时标和长时标指数（α_short、α_long）是病变组成与力学梯度的关键力学标志物。研究人员进一步应用自相似层级框架，以捕获细胞质、细胞和组织尺度的斑块异质性，从而获得从亚细胞到组织尺度的额外力学标志物（如E₁、η、E₂、E₃）。基于这些标志物，研究人员构建了一个多参数诊断模型，其性能优于传统弹性模量标准。该模型捕获分期和区域特异性轨迹，将力学特征与组织学耦合，以改善分期和风险评估，为增强动脉粥样硬化预测和诊断建立了可操作框架。

该研究发表于《Advanced Science》。动脉粥样硬化（atherosclerosis）是慢性炎症性疾病，也是多种致死性心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）的主要病理基础，特征为脂质沉积、动脉壁内斑块形成和血管组织病理性重构。随着疾病进展，动脉进行性硬化改变血管组织力学特性，进而募集免疫细胞并促进炎症浸润；这些血管力学微环境异常与斑块破裂风险及血栓介导急性冠脉综合征相关。当前临床管理仍强调晚期干预，如血运重建和抗血栓治疗，而非早期、力学指导的检测；传统血管造影和循环生物标志物常识别晚期疾病，早期风险分层受限。既往静态力学检测多关注弹性刚度，但单参数方法不能充分表征时间依赖响应，忽略斑块内空间异质性，限制其转化为稳健诊断。因此，研究人员旨在利用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）研究血管组织多尺度黏弹性力学参数，量化动脉粥样硬化疾病进展中的力学标志物，用于诊断和风险评估。研究假设整合动脉病变和斑块区域的生物力学参数与传统生理生化标志物可改善血管病变进展评估。研究人员通过高分辨率成像、关键炎症生物标志物定量和AFM纳米力学测试，重塑影像特征、生化标志物和力学参数相关性的力学生物学网络，并开发机器学习模型整合特征预测血管病变，提出同时纳入血管生物学特性和力学特性的联合分析方法。

关键技术方法不超过250字：样本来源为ApoE^?/?小鼠（C57BL/6背景）与C57BL/6野生型（WT）对照（Charles River Laboratories），在0、2、6、12、20周采集动脉组织。采用组织学染色、免疫组织化学和免疫荧光评估脂质、胶原、钙化及巨噬细胞极化；利用AFM微压痕、恒力蠕变和固定Z力松弛获取E_exp、D_creep、τ_1/2等。构建HHM框架与两阶段幂律流变分析，提取E₁、η、E₂、E₃、E_sum、α_short、α_long。采用集成softmax神经网络（EnsNN）并结合重复分层五折交叉验证、SHAP特征重要性分析。

研究结果如下。2.1 静态力学行为（Static Mechanical Behaviors）：通过Oil Red O、Masson和von Kossa染色及AFM压痕发现，早期无明显形态改变，中晚期出现脂质池（LP）、纤维帽（CF）、内膜纤维化（IF）和钙化。E_exp在0周最高（18.536 kPa），6周最低，12周为5.897 kPa，20周为9.906 kPa，未回到初始水平；CF从12周6.15 kPa升至20周12.06 kPa，接近两倍。LP最低且各时间点相似，IF较高且相对一致。但E_exp不能可靠区分12周CF与LP、20周CF与IF，也不能区分12至20周IF与LP，且变异较大，提示仅依赖弹性模量不足。2.2 动态力学响应（Dynamic Mechanical Responses）：通过蠕变和松弛测试发现，D_creep早期下降后随疾病进展增加，斑块区域呈LP最大、CF和IF较低的一致力学梯度；20周LP为717.3 nm，约为12周400.3 nm的两倍。τ_1/2从0周0.6424 s降至约0.38 s，并在6周保持恒定；12周CF和IF相近，LP显著较短；20周CF最长，τ_1/2较早期高约1.5至3倍，IF最短，LP居中。2.3 两阶段幂律流变（Two-Stage Power-Law Rheology）：通过AFM微流变和J_ind(t)的log–log分析获得α_short（0.01–0.1 s）和α_long（1–10 s）。早期α_short从0周0.4139降至2周0.3870，再升至6周0.5224；12周CF最高为0.7540；20周LP最高、IF最低、CF居中，且20周LP出现双峰，高流变峰约0.8，低流变峰约0.4。α_long在0–12周多无显著差异，12周CF最高为0.2190，并呈多峰分布。结果揭示斑块成分具有普适两阶段幂律行为，可评估黏弹性异质性和梯度。2.4 跨阶段与区域的多尺度力学异质性（Multiscale Mechanical Heterogeneity Across Stages and Regions）：扩展HHM框架，J₁表示细胞质弹性网络E₁和黏度η，J₂表示细胞骨架刚度E₂，J₃表示细胞外基质（extracellular matrix, ECM）横向刚度E₃。E₁随0至6周增加，12和20周CF最高、LP最低；η随时间增加且CF高于IF和LP；E₂呈类似趋势且区域差异更明显；E₃区域分离最强，CF显著升高并在20周进一步增加。ROC分析显示E₃、E_sum和E_exp跨阶段判别力最高，中晚期AUC接近0.9，尤其CF对LP；IF表现为中间表型，可分性较弱。E_sum=E₁+E₂+E₃与E_exp匹配良好，支持模型稳健性。2.5 生物标志物与生物力学特性的关系（Relationship Between Biological Markers and Biomechanical Properties）：qRT-PCR显示IL-6、IL-1β和TNF-α在0–2周低、6–12周急剧升高、20周下降但仍高于基线；IL-10在中段升高，20周最高。免疫组织化学显示CD68⁺巨噬细胞0–2周少，6–12周大量积聚，20周仍丰富但更外周。免疫荧光显示M1巨噬细胞在6–12周主导，M2在20周增加。相关网络显示促炎因子与软化标志物如α_short、D_creep、降低的E₁/E₂正相关，而IL-10呈相反相关。早期以“炎症和细胞质流化”模块为主，中期“炎症和细胞骨架降解”突出，晚期“修复性免疫和ECM硬化”出现，说明炎症与黏弹性重构紧密耦合。2.6 基于多参数的机器学习模型评估动脉粥样硬化病变（Multiparametric-Based Machine-Learning Model for Assessing Atherosclerotic Lesions）：基于218个病变力学测量，研究人员训练EnsNN比较单特征E_exp与多特征分类。全指标EnsNN平均留出准确率和宏F1约0.88，较仅E_exp模型（准确率0.637、宏F1 0.607）分别提高0.248和0.270，12个任务中11个宏F1改善。SHAP分析显示D_creep、τ_1/2、E_sum和η是最强预测因子。12周区域分类中E_exp、α_long和η主导，CF对IF近乎完美；20周中τ_1/2、η和E_exp主导，CF对LP近乎完美；IF与LP仍部分重叠。结果表明多尺度黏弹性参数编码可分类的力学指纹。

讨论与结论部分总结：该研究承认炎症重塑与力学变化之间为相关性，需机制验证；AFM为离体微尺度测量，而临床成像尺度更大且在生理负载下，不能假定AFM参数与在体弹性成像直接等价；需更大队列、人类标本、分组验证和跨模态比较。超声血管弹性成像、剪切波弹性成像和光学相干弹性成像（optical coherence elastography, OCE）等可为跨尺度桥梁；Marlevi et al.证明时空与频率依赖剪切波弹性成像可区分易损与稳定颈动脉斑块，剪切波指标与脂质丰富坏死核心、纤维帽特征等相关。未来应建立微尺度AFM力学与宏观或介观成像之间的定量关系，使临床可及成像间接反映微尺度斑块力学状态。研究结论部分翻译：本研究建立了多尺度黏弹性表征框架，用于研究动脉粥样硬化斑块在疾病进展中的时空力学重构。通过整合静态弹性、蠕变、应力松弛、层级黏弹性建模和两阶段幂律流变，证明斑块力学以分期和区域依赖方式演化，而非均匀硬化。动态黏弹性参数（D_creep、τ_1/2、α_short、α_long）及HHM模型参数提供了超越传统弹性模量的互补信息，揭示与斑块成熟相关的进行性力学异质性。多尺度力学签名与组织学和炎症分析整合，表明力学重构伴随斑块组成和炎症状态改变；但炎症与力学表型关联仍为相关性，需机制验证。集成神经网络分类器整合弹性、黏弹性和流变学参数，较单个指标改善斑块分期和区域分辨，提示不同斑块成分具有多尺度力学指纹；但基于离体小鼠组织且缺乏动物级外部验证，机器学习结果应视为探索性。局限性包括：炎症与力学关系需因果验证；AFM为离体微尺度，不能直接等同于在体弹性成像；需更大队列、人类标本、分组验证和跨模态比较。总体而言，该工作为表征斑块力学时空演化建立框架，并提供离体力学基准，为未来连接微尺度AFM与临床生物力学成像及发展力学知情评估奠定基础。