Lactiplantibacillus pentosus LP309胞外多糖提取物的功能特性、组成、生产优化及基因组学见解

《Journal of Functional Foods》：Functional features, composition, production optimization, and genomic insights into exopolysaccharide extracts produced by Lactiplantibacillus pentosus LP309

　　

油橄榄（Table olives）是一种发酵蔬菜，年产量约300万吨，在地中海盆地尤为重要。油橄榄加工过程中每年产生约1.95×109升发酵盐水；尽管通常排入蒸发池，但这一废物流可被重新利用，作为微生物生产高价值化合物的底物。本研究涉及从油橄榄中分离的Lactiplantibacillus pentosus LP309菌株（以下简称LP309）所产胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）提取物的结构表征、功能特性、生产优化及基因组学见解。研究人员评估了两种培养基——合成MRS肉汤（MRS-309）和马纳尼利亚橄榄盐水（SAL-309）——对EPS提取物产量的影响。研究人员采用高效尺寸排阻色谱法（high-performance size exclusion chromatography, HPSEC）、气相色谱法（gas chromatography, GC）和傅里叶变换红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）进行化学表征。两种提取物均为杂多糖（heteropolysaccharides），主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖构成，但其单糖组成比例不同。在MRS-309中获得的EPS提取物分子量为40 kDa，而在SAL-309中获得的则为70 kDa。两种提取物均表现出显著的抗氧化和抗炎活性，这是通过在人单核细胞白血病THP-1巨噬细胞系中测定活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平、促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-6（interleukin-6, IL-6））以及环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）/核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）蛋白表达来评估的。此外，研究人员采用响应面法（response surface methodology, RSM）优化EPS产量，确定最佳条件为：盐浓度1.8%、pH值约7.24、温度22.57–29.60 °C，预测产量约为527 mg/L。最后，研究人员对LP309基因组的计算机模拟分析（in silico analysis）鉴定出两个功能性EPS生物合成簇：一个位于染色体上，另一个位于质粒LP309pl1上。本研究表明，LP309菌株可作为油橄榄发酵的优良起始培养物，其产生的EPS提取物可作为潜在的食品工业功能性成分。

论文解读文章

研究背景与目的

油橄榄（Table olives）是全球重要的发酵蔬菜，年产量约300万吨，主要集中在环地中海地区。在其加工过程中，每年会产生约1.95×10⁹升的发酵盐水，这些废水通常被排入蒸发池，造成资源浪费和环境压力。然而，这种废水中富含营养物质，有望作为微生物发酵的底物，用于生产高附加值化合物。其中，胞外多糖（exopolysaccharides, EPSs）是一类由微生物分泌到环境中的天然、无毒、可生物降解的高分子量生物聚合物，在食品技术、制药和生物医学工程领域具有广泛的商业应用前景。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是公认的安全（Generally Recognized as Safe, GRAS）EPS生产者，其代谢产物被认为具有“食品级”地位。已有研究表明，特定乳酸菌菌株产生的EPS具有抗氧化、抗病毒、抗溃疡、抗癌、免疫调节等多种促进健康的功效。

尽管已有研究关注了油橄榄发酵盐水中EPS的产生，但关于利用特定乳酸菌起始培养物（starter）定向发酵所得纯化EPS的应用信息仍然匮乏。特别是对于从油橄榄中分离出的Lactiplantibacillus pentosus LP309菌株，其作为起始培养物能有效改善油橄榄发酵，但其产生的EPS的结构特征、功能活性、最优生产条件及其基因组层面的合成机制尚不清楚。因此，本研究旨在全面解析LP309菌株所产EPS提取物的结构、功能、优化其生产条件，并探索其基因组中负责EPS合成的基因簇，为其作为油橄榄发酵起始培养物及后续开发盐水副产物的应用提供科学依据。

主要研究方法

1. 1.
   EPS生产与纯化：分别使用合成MRS肉汤培养基（MRS-309）和西班牙式马纳尼利亚橄榄盐水（SAL-309）作为培养基，接种LP309菌株（初始接种量约5 log₁₀ CFU/mL）于37°C静态培养72小时。通过离心分离细胞和上清液，并使用碱液处理细胞沉淀以提取荚膜多糖。随后，采用三氯乙酸（trichloroacetic acid, TCA）去除蛋白，再用冷乙醇沉淀，最后通过透析和冷冻干燥获得纯化的EPS提取物。
2. 2.
   EPS结构表征：使用高效尺寸排阻色谱法（HPSEC）估算分子量；通过蒽酮比色法测定总糖含量；经三氟乙酸水解后，采用气相色谱法（GC）分析单糖组成；利用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）鉴定官能团和化学键。
3. 3.
   功能活性评价：以人单核细胞白血病THP-1细胞系分化的巨噬细胞为模型，通过MTT法评估细胞毒性；使用DCFDA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平以评价抗氧化活性；通过ELISA试剂盒定量促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的水平；采用蛋白质印迹法（Western blot, WB）分析环氧合酶-2（COX-2）、核因子红系2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）的蛋白表达。
4. 4.
   生产条件优化：采用中心复合设计（central composite design）的响应面法（RSM），考察盐浓度（0.03–8.77% NaCl）、pH值（3.48–8.52）和温度（16.59–33.41 °C）三个因素对EPS产量的影响，共进行16次实验。
5. 5.
   基因组分析：基于已发表的LP309基因组序列（Marín-Gordillo et al., 2026），利用BLASTp搜索UniProt数据库进行功能注释，使用DNA Features Viewer库可视化EPS生物合成基因簇的遗传组织和边界。

研究结果

3.1 LP309 EPS提取物的生产与表征

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  产量差异显著：在MRS培养基中，EPS产量（581.62 ± 46.57 mg/L）远高于橄榄盐水（47.67 ± 3.43 mg/L），前者约为后者的10倍，这归因于MRS中更高的营养（尤其是葡萄糖）含量。未接种的MRS对照仅产生5 mg/L的残留EPS，表明干扰极小。该产量超过了其他从油橄榄中分离的L. pentosus菌株，如LPS26（514 mg/L）和LPG1（566 mg/L）。
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  分子量与单糖组成受培养基影响：MRS-309的EPS分子量为40 kDa，而SAL-309的为70 kDa。两者均为杂多糖，但单糖比例迥异。MRS-309中葡萄糖（41.58%）、半乳糖（27.32%）和甘露糖（19.43%）为主；SAL-309则主要由葡萄糖（48.20%）和半乳糖（47.50%）构成，其余单糖含量接近1%。这表明同一菌株在不同培养基中会合成结构不同的EPS。
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  FTIR分析：两种EPS提取物的FTIR光谱吸收峰基本一致，仅强度不同，均显示出典型的多糖特征峰，如羟基（O-H）、亚甲基（-CH?-）、羧基、酰胺基、C-O-C振动以及α-糖苷键等。

3.2 功能特性

• •
  细胞毒性评估：MTT实验表明，两种EPS提取物在浓度低于50 μg/mL时对THP-1巨噬细胞无细胞毒性，确保了后续实验的安全性。
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  抗氧化活性：在脂多糖（LPS）诱导的氧化应激模型中，MRS-309在25和50 μg/mL浓度下分别将ROS水平降低28%和44%；SAL-309在6.25、12.5和50 μg/mL浓度下分别降低45%、45%和55%，效果更优，且呈剂量依赖性。
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  抗炎活性：两种EPS提取物均能显著抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6的产生。在50 μg/mL的最高浓度下，两种提取物均能显著降低这两种细胞因子水平。同时，它们还能显著下调促炎酶COX-2的蛋白表达。
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  信号通路验证：蛋白质印迹分析显示，MRS-309和SAL-309（尤其在高浓度下）能够上调抗氧化关键转录因子Nrf2及其靶基因HO-1的蛋白表达。这表明其抗氧化和抗炎作用可能通过激活Nrf2/HO-1通路，并与NF-κB通路发生交叉对话来实现。

3.3 LP309 EPS提取物生产的优化

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  模型建立：通过响应面法成功建立了EPS产量与盐浓度、pH值和温度的二次多项式模型（R2 = 0.771）。方差分析（ANOVA）显示模型显著（p = 0.0059），失拟项不显著（p = 0.20），表明模型拟合良好。温度和盐浓度的交互作用不显著，但pH和盐浓度是显著影响因子。
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  最优条件：数值优化结果表明，在盐浓度1.8%、pH 7.24、温度22.57–29.60 °C的条件下，预测的最大EPS产量约为527 mg/L。这与同属的L. pentosus LPG1菌株的最优条件（1.8%盐，pH 7.5，20.5 °C，492.74 mg/L）相似。

3.4 LP309 EPS簇的计算机模拟分析

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  基因簇鉴定：确认LP309基因组中存在两个功能性EPS生物合成簇，一个位于染色体上，另一个位于质粒LP309pl1上。质粒编码的EPS簇在乳酸菌中相对罕见。
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  基因功能注释：两个簇均包含非通用型EPS簇所需的必需基因，包括调控模块（如Cps4A/B/C）、引物糖基转移酶（Cps4E）、多种糖基转移酶（Cps4F/G/I）、翻转酶（Wzx, Cps4J）和多聚酶（Wzy, Cps4H）。染色体簇与L. plantarum WCFS1的cps4簇高度相似。

总结与结论

本研究系统阐明了从油橄榄中分离的Lactiplantibacillus pentosus LP309菌株所产胞外多糖（EPS）提取物的多方面特性。研究人员发现，该菌株产生的EPS是结构多样的杂多糖，其分子量和单糖组成受培养基成分（合成MRS vs. 橄榄盐水）的强烈影响。更重要的是，这些EPS提取物在体外细胞模型中展现出优异的抗氧化和抗炎活性，具体表现为清除活性氧（ROS）、抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）和下调炎症相关蛋白（COX-2），同时通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥保护作用。通过响应面法（RSM）优化，确定了有利于EPS高产的环境条件（低盐、近中性pH、温和温度）。最后，基因组分析揭示了该菌株拥有两个功能性EPS生物合成基因簇（一个在染色体，一个在罕见质粒上），为其强大的EPS生产能力提供了遗传基础。综上所述，LP309菌株不仅可作为优良的油橄榄发酵起始培养物，其产生的EPS提取物也因其安全性和突出的生物活性，有望作为功能性成分应用于食品工业，从而实现油橄榄加工副产物的增值利用。