光交联壳聚糖/甲基丙烯酸化透明质酸纳米复合物用于经皮抗原递送和树突状细胞激活

《Journal of Industrial and Engineering Chemistry》：Photocrosslinked chitosan/methacrylated hyaluronan nanocomplexes for transcutaneous antigen delivery and dendritic cell activation

# 皮肤抗原递送综述翻译## 摘要经皮抗原递送对于慢性皮炎的治疗以及有效的疫苗接种至关重要，因为它靶向皮肤驻留的抗原呈递细胞，同时避免了首过代谢。然而，其应用受到皮肤强屏障功能的限制。尽管已开发出多种基于颗粒的平台用于将抗原递送至皮肤，但无一能完全克服这些限制。本研究设计了壳聚糖（CS）/透明质酸（HA）基纳米复合体用于卵清蛋白（OVA）的经皮递送。通过精确控制CS/HA混合比，该系统成功通过静电相互作用负载了OVA；此外，引入甲基丙烯酸酯化透明质酸（HAMA）通过光交联提高了OVA负载效率和颗粒稳定性。在猪皮渗透试验中，观察到纳米复合体向表皮的大量递送。这表明纳米复合体穿透了角质层并可能到达皮肤树突状细胞（DCs）。装载OVA的CS/HAMA纳米复合体激活了DCs，并在mRNA水平上增加了成熟标志物的表达。值得注意的是，高含量的CS显著增强了DC激活效果。这表明CS不仅参与复合物化（货物负载），还作为免疫激活的佐剂发挥作用。## 引言疫苗接种通常通过向体内递送抗原或抗原片段来进行，从而通过适应性免疫反应产生特异性抗体。抗原通常通过注射或口服途径给药[1]。注射是最常见的方法，可以刺激强烈的免疫反应；然而，其侵入性常因疼痛和感染导致患者依从性低。相比之下，在口服疫苗中，抗原通过Peyer斑上皮层的微皱褶细胞进行跨细胞转运，并被下层淋巴组织中的树突状细胞（DCs）捕获，从而启动黏膜和系统性免疫反应。该途径非侵入性，患者依从性高，并允许自我给药[2]，[3]。然而，口服疫苗可能效果较差，因为抗原在酸性胃环境以及胃肠道转运过程中易被消化酶降解。这些过程减少了到达诱导位点的完整抗原量，并可能损害构象性B细胞表位。此外，通过胃肠道吸收的成分会经历肝脏首过代谢，减少其全身暴露并可能减弱随后的免疫激活[3]。经皮抗原递送通常被认为是一种非侵入且有效的途径，可绕过胃肠道转运。因此，它避免了肝脏首过代谢[4]，[5]。尽管有这些优势，皮肤的屏障功能是主要障碍。皮肤最外层——角质层，由富含角蛋白的角质细胞嵌入高度有序的细胞间脂质层中组成，这阻止了外源化合物和许多药物分子的渗透。因此，被动扩散主要限于分子量小于500 Da的脂溶性分子，而大分子蛋白质抗原无法有效穿透皮肤屏障[6]。尽管如此，皮肤提供了有利的免疫激活位点。皮肤中的抗原呈递细胞（APCs），特别是表皮中的朗格汉斯细胞和真皮中的DCs，在抗原捕获、加工和呈递中发挥关键作用，在引流淋巴结中启动适应性免疫反应[7]。已探索多种策略来克服皮肤屏障以实现经皮疫苗接种，范围从化学渗透促进剂到物理技术。化学促进剂（如二甲基亚砜和表面活性剂）暂时扰乱角质层中的细胞间脂质和蛋白质，从而增加渗透性。尽管操作简便，但这些试剂通常仅提供适度的渗透增强，在较高浓度下还可能引起皮肤刺激或红斑[8]。物理技术包括电渗透、声渗透和微针。在药物递送方面，这些方法比化学促进剂更有效。然而，它们需要专用设备，重复使用可能引起皮肤刺激或屏障损伤[1]，[9]。替代的基于载体的方法可以在最小化皮肤损伤的情况下递送抗原。纳米颗粒可以作为疫苗载体用于靶向递送，通过包封抗原或将其固定在表面来实现。由于其尺寸小，纳米颗粒可以通过间隙空间迁移，并保护抗原免受物理化学和酶降解[5]，[10]，[11]。纳米颗粒载体不仅促进有效递送，还通过共刺激免疫细胞作为免疫刺激佐剂发挥作用。此外，表面功能化靶向配体提供了将抗原导向特定组织或免疫细胞亚群的额外灵活性[11]。在抗原递送的纳米颗粒平台中，脂质基系统（如脂质体和SLNs）和聚合物纳米颗粒研究最为广泛。脂质基纳米颗粒为包封常见抗原提供了便利平台；然而，其递送效率对脂质组成高度敏感，脂质层的稳定性仍是一个重大挑战[12]。聚合物纳米颗粒通常使用生物相容且可生物降解的聚合物制备，与脂质基组装体相比相对稳定。此外，其高度可调的物理化学性质，如精确的尺寸控制、表面电荷调节和可编程降解性，允许增强皮肤屏障渗透以及药物疗效。因此，它们已成为经皮药物递送的首选平台[4]，[13]。壳聚糖（CS）是一种生物相容且可生物降解的多糖，由β-1,4键合的D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺单元组成。D-葡萄糖胺单元含有可质子化的游离氨基，在弱酸性条件下使CS带正电荷。这种阳离子特性使CS能够与阴离子分子（如药物、蛋白质或聚合物）形成聚电解质复合物[14]，[15]。例如，氟化壳聚糖（FCS）和模型抗原卵清蛋白（OVA）自组装成FCS-OVA纳米颗粒，穿透角质层并到达真皮[10]，[11]。CS基纳米载体强烈粘附于皮肤表面，改善局部沉积，并放松上皮细胞间的紧密连接。这导致有效的免疫反应[16]，[17]。尽管CS作为抗原载体具有优势，但其使用受到限制，因为CS基纳米颗粒的性质对pH和离子强度等环境因素高度敏感，导致胶体稳定性低和抗原过早释放[18]。此外，CS的强正电荷限制了皮肤渗透，导致CS纳米颗粒在大多数研究中停留在皮肤表面或表皮内。透明质酸（HA）是细胞外基质中的主要糖胺聚糖（GAGs）之一，在生物医学应用中广泛使用（如微针、纳米颗粒、润滑剂和水凝胶）[7]，[19]。十年来，研究表明HA-抗原缀合物或HA纳米颗粒可以穿透角质层并到达表皮及真皮。HA的皮肤渗透部分归因于HA的高亲水性和两亲性，这使HA组装体能够与角质层中的水相区域和细胞间脂质层相互作用。HA还可与角质细胞和真皮成纤维细胞上的CD44等受体结合，一旦载体到达活体皮肤层，即支持细胞结合、摄取和局部滞留[7]，[20]，[21]。此外，CS/HA聚电解质复合物已配制成可注射或原位形成水凝胶，表明CS和HA可以形成稳定和生物相容的网络用于生物医学用途[22]。然而，在疫苗接种的背景下，HA本身通常不是强免疫刺激成分，HA基载体应与额外的佐剂或免疫调节剂结合，以产生强大的全身或黏膜免疫反应[20]，[23]。因此，在经皮疫苗设计中，HA被视为一种渗透增强和靶向基质，与其他功能成分整合以实现强有力的免疫接种。本研究假设将CS的免疫刺激特性与HA的皮肤渗透能力相结合，可以产生一种用于经皮抗原递送的协同平台。与现有需要复杂化学缀合的HA基递送系统不同[20]，[21]，这种方法允许通过阳离子CS与阴离子抗原的直接静电复合物化来直接引入阴离子抗原。同时，整合的HA组分预计可以调节净表面电荷，促进更深的皮肤渗透。作为概念验证研究，CS/HA/OVA纳米复合体通过顺序程序和不同配方形成，并优化制备过程。然后通过采用甲基丙烯酸酯基团对HA进行光交联来进一步稳定纳米复合体。相应地，评估了交联对纳米复合体稳定性的影响。使用体外猪皮渗透测试评估了不同配方的纳米复合体的经皮递送性能。最后，使用THP-1衍生的DCs评估DC成熟情况，以评估其作为经皮抗原递送平台的潜力。## 材料壳聚糖（CS；水溶性壳聚糖盐酸盐，≥ 88.5%）购自奇博生物科技（中国青岛）。其粘度平均分子量为20 kDa，脱乙酰度≥ 85%，根据制造商提供的规格。透明质酸钠（化妆品级，纯度：96.9%）购自山东福斯瑞达生物科技（中国曲阜）。通过凝乳滤色谱法使用葡聚糖标准测定的数均分子量为1,756 kDa（图S1）。## 通过简单混合方法形成CS/HA/OVA纳米复合体在复合物化之前，将高分子量HA水解以降低其分子量。所得HA的数均分子量为30 kDa（图S1）；这用于纳米复合体制备以防止聚集形成。通过将稀释的CS和HA溶液简单混合来实现复合物化。通过测试各种聚合物浓度，发现当总聚合物浓度超过0.05 wt%时，分散液变得明显浑浊并形成[聚集]。## 结论成功设计了新型且高度稳健的经皮抗原递送平台，克服了传统聚合物纳米载体的固有不稳定。通过将稀释的CS和HA溶液混合来实现复合物化，允许通过改变混合比轻松调节纳米复合体的表面电荷。然而，CS/HA纳米复合体在富含盐的介质（即PBS）中表现出不稳定，导致聚集和货物容量受损。这个关键瓶颈[需要解决]。## 作者贡献声明**Hong Sik An：** 撰写初稿、调查研究。**Jeongyun Hong：** 调查研究、验证。**Minsoo Park：** 方法论。**Sunghyun Park：** 方法论。**Yoo Yong Kim：** 撰写-审阅与编辑。**Chang Seok Ki：** 撰写-审阅与编辑、监督。## 利益冲突声明作者声明他们不存在已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。## 致谢本研究由首尔大学-COSMAX技术孵化中心（TIC）资助。本工作由首尔大学SOFT Foundry管理（0681-20240065）。## 参考文献Hong Sik An|Jeongyun Hong|Minsoo Park|Sunghyun Park|Yoo Yong Kim|Chang Seok Ki