心脏传导系统转录异质性跨物种保守性与差异性的单细胞比较研究

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Conservation and divergence of transcriptional heterogeneity in the cardiac conduction system

脊椎动物的心脏传导系统包含保守性和差异性的基因程序。保守性基因与人类传导表型和疾病相关联。通过基因调控网络推断识别出保守性调控因子。保守性窦房结基因在干细胞来源的心肌细胞中得到验证。

研究背景与现存问题

心脏传导系统由特化的心肌细胞群体组成，负责在整个心脏内启动和传播电信号。该系统各组成部分的发育和独特功能依赖于专门的基因表达谱，例如 Hcn4 在窦房结高表达以实现自律性，而 Cx40 由 Gja5 编码并在心室传导系统中富集以支持快速传导。这些异质性基因程序由一系列转录因子建立和维持，如Shox2、Isl1和Tbx18作用于窦房结，Tbx3作用于窦房结、房室结和近端心室传导系统，以及Nkx2-5、Etv1和Irx3作用于心室传导系统。这些转录因子的缺失会导致小鼠出现电生理异常，类似于人类的心律失常和传导障碍，表明心脏传导系统基因程序具有普遍保守性。尽管多种模式生物被广泛用于心脏传导系统研究，且电脉冲产生、传播和结构组织的整体模式在不同物种间具有可比性，但物种特异性的生理差异使得从模式生物到人类生理和疾病的直接转化变得复杂。相应地，传导相关基因表达在不同物种间的保守性和差异性程度仍不清楚，即使是在密切相关的物种之间。此外，发育期与成熟期心脏之间存在差异，研究人员对心脏传导系统在分子水平上的成熟过程的认知仍然有限。单细胞和单核RNA测序及空间转录组学的发展已开始揭示不同物种心脏传导系统的转录组图谱，但大多数研究集中于单个心脏传导系统组分，主要是窦房结，缺乏系统性的跨物种分析，且心脏传导系统群体在更广泛的心脏测序研究中往往未被注释。这些空白凸显了进行系统性、跨物种、跨阶段的转录程序分析的必要性，这对于阐明传导疾病的病理机制、开发靶向特定心脏传导系统区域的治疗策略以及将干细胞重编程为心脏传导系统样细胞等转化应用至关重要。

研究内容与结论

在本研究中，研究人员进行了比较分析，以增强对心脏传导系统转录异质性在物种和发育过程中保守性与差异性的理解。研究人员鉴定出了进化上保守的区域性心脏传导系统标志物，以及那些特定于某一物种和/或发育阶段的标志物。此外，研究人员探究了这些保守基因程序异质性表达背后的基因调控网络，并通过检测遗传变异与传导疾病之间的关联评估了其转化相关性。该研究的重要性在于，它系统地揭示了跨物种心脏传导系统分子程序的保守与分化特征，为利用动物模型研究人类传导疾病、开发靶向治疗策略以及生物起搏器等再生医学应用提供了关键的分子基础。

主要技术方法

研究人员利用了来自人类、小鼠、大鼠、斑马鱼和青鳉鱼的九个单细胞和单核转录组数据集，涵盖发育期和成熟期阶段。同时使用了空间转录组数据，包括人类胎儿全心脏切片的MERFISH成像和成人心脏各区域的Visium切片。通过独立的质量控制和细胞注释流程，基于已确立的标志基因定义了窦房结、房室结、His束和浦肯野纤维等心脏传导系统组分。运用无监督层次聚类评估不同物种和发育阶段中心脏传导系统群体的相似性。采用SCENIC算法进行基因调控网络推断和聚类，系统性地绘制转录因子活性及其区域特异性图谱。最后，通过全基因组关联研究和罕见编码变异分析，评估保守性心脏传导系统标志物与心脏传导相关性状和疾病的关联。

研究结果

2.1 人类、小鼠、大鼠和斑马鱼中心脏传导系统细胞群体的鉴定

研究人员利用九个人类、小鼠、大鼠、斑马鱼和青鳉鱼的单细胞/单核转录组数据集，以及人类胎儿和成人的空间转录组数据，通过独立的质量控制和基于标志基因的细胞注释，成功鉴定了所有主要心脏传导系统组分。无监督层次聚类显示，心脏传导系统组分主要依据其解剖区域聚类，表明相应心脏传导系统组分在不同物种和发育阶段之间存在显著的转录组相似性。

2.2 人类和小鼠间保守的区域特异性心脏传导系统转录本

通过比较人类和小鼠的数据，研究人员发现了共享的全局心脏传导系统分子特征，其中 ID3 被鉴定为发育期和出生后小鼠以及发育期人类的泛心脏传导系统标志物。在节点区域，保守基因包括 TBX3、HCN1、PDE1A 和 RSRC1 等。在心室传导系统中，仅有少数基因在两个物种和两个发育阶段均保守，包括 IRX3、IRX5 和 MPPED2。

2.3 人类和小鼠间保守的心脏传导系统组分特异性转录本

研究人员进一步鉴定了每个心脏传导系统组分特异性的分子标志物。窦房结是唯一在所有物种和发育阶段都显示保守标志物的区域，包括 SHOX2、PDE1A、GNAO1、PRDM6 和 VSNL1。房室结中，BMP2 和 RSPO3 分别在不同阶段保守。His束中，FBN2 在成年/出生后阶段保守。浦肯野纤维中，发育期的保守基因包括 ANGPT1、SEMA3A、IRX3 等小梁基因。

2.4 大鼠中心脏传导系统转录组的保守性与物种特异性

将分析扩展到成年大鼠，研究人员发现了一组核心的、在三个物种中均保守的节点和组分特异性标志物，如 Hcn1、Pde1a、Vsnl1 和 Shox2 在窦房结，以及 Rspo3 在房室结。同时，也观察到了大鼠特有的标志物，如窦房结中的 Cacna1a 和房室结中的 Cntn4。

2.5 斑马鱼和青鳉鱼中心脏传导系统转录组的保守性与物种特异性

在斑马鱼和青鳉鱼中，vsnl1a 是所有物种和阶段中唯一保守的节点标志物。多个转录因子如 shox2、gata6 和 isl1 在发育期斑马鱼、人类和小鼠的节点中保守。此外，斑马鱼和青鳉鱼的小梁心肌细胞与哺乳动物浦肯野纤维共享部分基因程序，如 nppa 和 angpt1。

2.6 保守性窦房结基因表达的验证

研究人员通过将人多能干细胞定向分化为心室样、心房样和窦房结样心肌细胞，验证了多个保守性窦房结基因的表达，如 PDE1A、GNAO1、FZD7 和 CNTN4 在窦房结样细胞中显著富集。

2.7 心脏传导系统异质性的保守性转录调控

通过SCENIC分析，研究人员绘制了人类和小鼠心脏传导系统中转录因子的活性图谱，鉴定出多个区域特异性的保守性调控因子，如窦房结中的GATA6、ISL1和SHOX2，以及心室传导系统中的IRX3。重建的保守性基因调控网络揭示了如ETV1调控窦房结和浦肯野纤维基因，以及AP-1网络蛋白共同调控 IRX3、TBX3 等关键心脏传导系统标志物。

2.8 保守性区域性标志物的疾病关联

通过全基因组关联研究和罕见编码变异分析，研究人员发现57个心脏传导系统富集基因与31种心脏传导相关性状相关联，69个基因与传导疾病显著相关。除了已知的 HCN4 和 SCN5A，还发现了如 CDH11 与心率、HBEGF 与PR间期、GNAO1 和 UCHL1 与房室阻滞等新的关联。

讨论与结论

本研究系统比较了人类、小鼠、大鼠、斑马鱼和青鳉鱼在不同发育和成熟阶段的心脏传导系统单细胞转录组数据。研究人员开发了一个交互式网络应用程序以便于数据共享和探索。比较分析揭示了支撑心脏传导系统核心发育和功能的进化保守性、区域特异性基因程序。许多新发现的保守性心脏传导系统富集基因尚未在该背景下进行功能表征，它们可能代表新的候选基因，其中一些与人类传导疾病相关。例如，转录因子 ATOH8 和 GATA5 以及 GNAO1 和 UCHL1 的罕见编码变异与房室阻滞相关，而 ALCAM、MPPED2、TGM2 和 NFIA 的变异与房室阻滞和/或束支阻滞相关。总之，这些发现突显了进化保守的、区域特异性的心脏传导系统基因很可能具有功能和病理学重要性，扩展了传导疾病的候选基因库。