整合时序转录组与单细胞RNA测序揭示速效救心丸对心肌梗死的保护作用机制

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Integrative approach combining temporal bulk transcriptomics and single-cell RNA sequencing reveals cardioprotective effects of Suxiao Jiuxin Pill on myocardial infarction

摘要 靶向心肌梗死（MI）中的免疫-炎症反应已成为一种有前景的策略，但多种免疫细胞群体之间高度动态且复杂的相互作用限制了其疗效。速效救心丸（SJP）作为一种经典的中药（TCM）复方制剂，已被广泛用于治疗心肌梗死。然而，其确切的作用机制仍知之甚少，尤其是在梗死后不同愈合阶段以及单细胞分辨率下的免疫调节作用方面。在本研究中，研究人员首先采用时序批量RNA测序和靶向代谢组学，描绘了SJP在心肌梗死后心脏修复过程中调控的转录动态变化。随后，应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）全面解析了SJP对梗死心脏免疫微环境的影响。时序批量转录组分析表明，SJP通过促进血管生成、抑制炎症和重编程心肌能量代谢来促进梗死后心脏修复。scRNA-seq进一步揭示，SJP重塑了巨噬细胞亚群组成，增强了Prg4+巨噬细胞亚群的丰度和修复功能。此外，SJP重编程了中性粒细胞亚群组成和代谢状态，同时恢复了调节性T细胞（Treg）/辅助性T细胞17（Th17）的平衡和B细胞稳态。因此，SJP显著的心脏保护作用主要通过重编程心肌梗死后心脏免疫细胞格局并促进从炎症反应向修复表型的转变来实现。这些发现表明，利用中药多组分特性恢复心脏免疫微环境的稳态，可能为促进心肌梗死后从炎症向组织修复的转变提供一种有前景的新策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

心血管疾病持续构成全球重大健康负担，2021年全球心血管疾病患者达6.12亿例，占总死亡人数的26.8%。缺血性心脏病，尤其是急性心肌梗死，仍是心血管死亡的主要原因。心肌梗死期间，冠状动脉血流的长时间中断导致严重的心肌缺血缺氧，引起心肌细胞功能障碍乃至死亡。尽管再灌注治疗至关重要，但再灌注本身常引发"二次打击"现象，加重心肌损伤，据估计再灌注损伤约占梗死总量的50%。目前缺乏普遍有效的治疗策略来促进心肌梗死后心脏修复，这已成为限制患者长期预后的关键因素。

心肌梗死后心脏愈合是一个涉及炎症级联反应、氧化应激和线粒体功能障碍的复杂过程，通常分为三个重叠阶段：炎症期、增殖修复期和成熟期。靶向免疫-炎症反应已成为心肌梗死治疗的有前景策略，现有免疫治疗策略包括清除特定免疫细胞亚群、抑制免疫细胞募集、阻断炎症信号通路以及调节免疫细胞极化等。然而，尽管大量临床前研究证实了这些方法的心脏保护作用，临床转化仍十分有限，主要原因在于免疫细胞固有的异质性和可塑性。此外，心肌梗死后失调的免疫微环境涉及多种免疫细胞和介质之间的复杂相互作用，使得靶向单一细胞因子或免疫细胞类型难以产生足够的治疗获益。因此，需要一种整合性、系统层面的免疫调节方法。在此背景下，中药凭借其多组分、多靶点的特性，可能在调节炎症和恢复免疫平衡方面具有独特优势。

速效救心丸由川芎和冰片组成，在中国广泛用于治疗心绞痛和心肌梗死。临床研究表明，速效救心丸可改善急性冠脉综合征患者早期再灌注后的心功能和生存质量，并降低主要不良心血管事件发生率。药理学研究证实速效救心丸能减轻心肌缺血、改善血流和保护心肌细胞，同时其活性成分具有免疫调节潜力。然而，其确切作用机制，特别是在心肌梗死后不同愈合阶段和单细胞水平上的机制，仍不清楚。因此，本研究旨在通过整合多组学策略，系统阐明速效救心丸促进心肌梗死后心脏修复的免疫调节机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用多种关键技术方法开展研究：采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱和气质联用鉴定速效救心丸化学成分；建立大鼠心肌缺血再灌注模型，分为假手术组、模型组、速效救心丸高剂量组、低剂量组和阿司匹林组；利用超声心动图评估心功能，苏木精-伊红染色和天狼星红染色评估心肌组织学改变；采用酶联免疫吸附测定检测血清心肌损伤标志物和组织炎症因子水平；进行时序批量RNA测序描绘梗死后第1、3、7天的心脏转录动态变化；采用靶向代谢组学分析能量代谢相关代谢物；应用单细胞RNA测序对梗死后第7天心脏CD45⁺免疫细胞进行解析；结合流式细胞术验证巨噬细胞极化和Treg/Th17平衡变化；通过体外实验评估速效救心丸对中性粒细胞功能的影响。

三、主要研究结果

3.1 速效救心丸的化学成分鉴定

化学研究共鉴定出速效救心丸192种水溶性成分和22种挥发性成分，包括13种烯烃、13种醇类、2种醛类、9种酮类、44种酯类、35种杂环类、22种挥发性化学成分和76种其他化合物。

3.2 速效救心丸对心肌梗死的保护作用

超声心动图显示模型组射血分数和缩短分数显著降低，速效救心丸高剂量组和阿司匹林组改善最为明显。苏木精-伊红染色显示速效救心丸治疗减轻了心肌损伤、改善了心肌细胞排列、减轻了水肿和炎性浸润。血清心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I和乳酸脱氢酶水平进一步证实了速效救心丸的心脏保护作用。鉴于高剂量组在多项指标上持续表现出更优疗效，后续机制研究选用高剂量组。

3.3 梗死后心脏修复过程中的阶段性分子重塑

时序转录组分析显示心肌梗死后心脏转录组呈现动态、阶段特异性的重编程。模糊C均值聚类识别出9个基因簇，其中簇5与白细胞迁移和缺血反应相关，簇6反映炎症反应和内皮增殖，簇1富集于细胞外基质重塑、血管生成和伤口愈合。梗死后第1天以急性损伤反应为主，第3天出现明显炎症反应增强，第7天过渡到修复性重塑阶段。

3.4 速效救心丸促进梗死后心脏愈合的分子轨迹

梗死后第1天，速效救心丸调节316个基因，促进氧转运和活性氧解毒，抑制趋化因子介导的炎症反应，下调Cxcl1、Ccl2、Ccl3、Ccl7表达，降低丙二醛和氧化型谷胱甘肽水平，上调总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽表达。第3天，速效救心丸调节753个基因，激活Rap1信号、吞噬体和溶酶体功能，抑制补体和凝血级联、IL-17信号和Toll样受体通路，降低促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，增加抗炎因子TGF-β，并增强胶原纤维沉积。第7天，速效救心丸调节3826个差异表达基因，激活氧化磷酸化、三羧酸循环、Apelin和过氧化物酶体增殖物激活受体通路，抑制Toll样受体、PI3K-Akt和细胞因子-细胞因子受体相互作用等促炎通路，上调VEGFA和VEGFR2蛋白表达，增强CD31信号。靶向代谢组学鉴定出8种差异代谢物，整合分析显示速效救心丸抑制糖酵解关键酶表达，上调三羧酸循环酶表达，促进能量代谢从糖酵解向氧化磷酸化转变。

3.5 速效救心丸重编程梗死后心脏免疫细胞格局

单细胞RNA测序共获得71248个高质量细胞，鉴定出22个细胞簇和7种免疫细胞谱系。心肌梗死后单核吞噬细胞系统显著扩增，T细胞和NK细胞比例降低，速效救心丸治疗部分恢复了这些免疫细胞失衡。

3.6 速效救心丸调节梗死后单核吞噬细胞系统反应

单核吞噬细胞系统分为树突状细胞、巨噬细胞、经典单核细胞和非经典单核细胞四类。速效救心丸未显著改变各亚群丰度，但广泛激活了血管生成和组织修复相关通路，同时抑制炎症细胞因子产生和外周白细胞募集相关程序。

3.7 速效救心丸重塑巨噬细胞亚群组成并引导修复性命运决定

巨噬细胞分为8个转录组学上不同的亚群，包括4个CCR2⁺募集巨噬细胞群体和4个CCR2^-驻留巨噬细胞群体。UCell评分和流式细胞术证实速效救心丸显著增加M2巨噬细胞丰度，适度减少M1巨噬细胞。心肌梗死后CCR2⁺亚群N4、N6、N7扩增，N8减少，速效救心丸有效逆转了这些变化。CCR2^-亚群N1、N2、N3在梗死后减少，速效救心丸治疗后显著恢复。值得注意的是，Macrophage_N5亚群在假手术心脏中几乎不存在，梗死后出现，速效救心丸治疗后进一步扩增。拟时序分析揭示了从Macrophage_N2经Macrophage_N3向修复性Macrophage_N5分化的轨迹，速效救心丸显著强化了这一修复性分化路径。

3.8 速效救心丸增强Macrophage_N5（Prg4⁺）亚群的丰度和修复功能

K-means聚类分析显示Macrophage_N5特征基因涉及伤口愈合、应激反应、血管生成和炎症调节等多种功能。基因集富集分析表明速效救心丸增强了心脏和血管系统发育相关通路。火山图分析鉴定Prg4为Macrophage_N5最具特异性的标志基因，速效救心丸治疗后表达进一步升高。双重免疫荧光染色证实速效救心丸促进了梗死区Prg4⁺CD68⁺巨噬细胞的积累。

3.9 速效救心丸重编程梗死后中性粒细胞亚群组成、代谢状态和分化轨迹

UCell评分显示心肌梗死后N1型中性粒细胞显著增加，N2型减少，速效救心丸部分恢复N2特征。梗死后第7天中性粒细胞呈现糖酵解增强和氧化磷酸化受损的代谢转变，速效救心丸显著逆转了这一失衡。中性粒细胞分为6个亚群，速效救心丸有效恢复了Neutrophil_N1和N3频率，显著抑制了促炎性Neutrophil_N6的扩增。拟时序分析显示分化从高度炎症的Neutrophil_N6经N5向修复性N1进行，速效救心丸促进了这一修复性分化轨迹。体外实验证实速效救心丸促进中性粒细胞向修复表型转变。

3.10 速效救心丸恢复梗死后Treg/Th17平衡

T和NK细胞分为7个亚群。心肌梗死后CD4⁺初始T细胞向Th17和Treg双向分化。速效救心丸抑制Th17扩增并增强Treg富集，流式细胞术证实了这一结果。功能富集分析显示速效救心丸抑制Th17增殖和ATP代谢，增强Treg介导的抗炎信号和心脏修复相关基因表达。尽管增加了CD8⁺效应T细胞丰度，但有效减弱了其炎症活性和细胞毒性效应功能。

3.11 速效救心丸抑制促炎性B细胞扩增并恢复修复性B细胞稳态

B细胞分为5个亚群。B cell_N1和N4为促炎性亚群，梗死后显著扩增，速效救心丸有效抑制了其异常扩增。B cell_N2具有调节性B细胞特征，参与血管生成和IL-10产生，梗死后显著减少，速效救心丸治疗后有效恢复。免疫荧光染色证实了这些结果。

四、讨论与结论

心肌梗死仍是全球心血管死亡的主要原因。尽管以再灌注为中心的临床策略显著降低了急性期死亡率，但随后的持续炎症反应和修复失衡仍是驱动不良心脏重构和长期心力衰竭的根本机制。本研究系统评估了速效救心丸促进梗死后心脏愈合的治疗效果，并通过整合多组学分析策略阐明了速效救心丸重塑心脏免疫微环境稳态的潜在机制。鉴于现有主要依赖免疫细胞清除来改善心脏重构的干预策略临床疗效有限，研究人员提出一种新的治疗范式：协调免疫细胞的表型重编程而非仅仅抑制其活性，从根本上更符合心脏修复的生物学需求。

速效救心丸作为一种成熟的中药复方制剂，已在临床广泛用于冠脉疾病和心肌梗死的管理。大量临床和临床前研究已明确其心脏保护功效，核心机制涵盖抗氧化活性、抑制血小板聚集、改善内皮功能障碍和系统性抗炎作用。本研究通过时序批量转录组学、靶向代谢组学和单细胞RNA测序的整合分析，揭示了速效救心丸通过重编程心脏免疫细胞格局促进心肌梗死后心脏修复的机制：速效救心丸重塑巨噬细胞亚群组成，增强Prg4⁺巨噬细胞亚群的丰度和修复功能；重编程中性粒细胞亚群组成和代谢状态，促进从促炎向修复表型的转变；恢复Treg/Th17平衡；抑制促炎性B细胞扩增并恢复修复性B细胞稳态。这些发现表明，利用中药多组分特性恢复心脏免疫微环境稳态，可能为促进心肌梗死后从炎症向组织修复的转变提供一种有前景的新策略。该研究发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。