基于气液界面（ALI）的微流控类器官芯片在头颈部肿瘤与药物筛选中的研究进展

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Advances of air-liquid interface-based microfluidic organoid chips for head and neck tumor and drug screening

头颈部肿瘤（head and neck tumor）主要为鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma），起源于鼻旁窦、鼻腔、口腔、咽或喉。这些解剖区域构成上呼吸道和上消化道，执行呼吸和吞咽等核心生理功能。长期暴露于病毒感染、环境污染物（例如酒精、香烟烟雾）和高温刺激所诱导的慢性复发性炎症，最终促进肿瘤发生。然而，肿瘤的高度异质性严重限制了当前治疗策略的疗效。目前，解析癌细胞与组织驻留细胞之间的微环境串扰，对于抑制肿瘤进展和克服治疗耐药至关重要。与其他肿瘤相似，气液界面（air-liquid interface, ALI）模型已成为研究肿瘤免疫微环境、癌前病变和环境因素诱导肿瘤发生的核心技术。头颈部肿瘤类器官（organoid）培养应使其在体外紧密类似相应的体内器官，在免疫应答、组织结构和生理特性方面。与传统模型不同，微流控芯片（microfluidic chip）可精确模拟天然肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），并实现药物和培养基的动态递送。此类集成系统支持高通量药物筛选，有助于克服传统研究模型的局限性，并极大促进头颈部恶性肿瘤精准治疗的发展。本综述总结了类器官、ALI培养和微流控平台的技术特征、应用和转化前景，旨在为头颈部肿瘤的临床前研究和治疗优化提供参考。

该论文发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。头颈部恶性肿瘤指发生于颅底以下、胸腔以上，主要影响口腔、口咽、下咽和喉的异质性肿瘤群，包括鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）、鼻腔癌、口腔癌、舌癌和喉癌。其中头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）来源于上皮组织，占约90%，与吸烟、饮酒、嚼槟榔、口腔卫生差、局部菌群改变以及人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）和EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）感染相关。HNSCC具有高侵袭性、早期远处转移和高复发倾向。尽管手术联合放化疗的综合治疗取得进展，但早期HNSCC复发率为20%–30%，局部晚期达50%；放化疗方案难以覆盖肿瘤异质性，生物标志物也鲜有进入常规临床。因此，个性化药物敏感性检测对优化选药、提高疗效和减少毒副反应至关重要。传统二维（two-dimensional, 2D）细胞培养仅保留部分肿瘤细胞特征，动物模型受伦理和种属差异限制。类器官（organoid）为三维（three-dimensional, 3D）体外培养物，可重现体内对应组织的结构和功能；患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids, PDOs）保留原肿瘤遗传和分子特征。但头颈部肿瘤类器官仍存在专用培养基成本高、流程复杂、难以重现致癌病毒和环境污染物驱动肿瘤发生、难以维持天然病变复杂组织结构和免疫组成等限制。微流控技术可精确调控类器官培养微环境，如生化因子浓度、剪切应力和营养供应，并支持高通量并行培养。气液界面（air-liquid interface, ALI）模型可克服浸没培养局限，在顶端暴露空气、基底侧供给培养基，模拟上呼吸道和上消化道腔面。因此，研究人员系统总结类器官、ALI培养和微流控平台的技术特征、应用和转化前景，并设计开发用于HNC的微流控类器官芯片，以解决传统模型在HNC病理特征和药物反应模拟中的不足，为探索肿瘤发生机制、识别预测性生物标志物、评估放化疗疗效和开发个性化治疗方案提供新工具。

关键技术方法概述：该综述围绕患者来源类器官（PDOs）与ALI微流控芯片展开。芯片为四层模块化设计，第一层为聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）液体/空气进出口层，第二、三层分别为空气通道和液体通道，第四层为玻璃基底，经氧等离子键合。液体通道设类器官培养腔，类器官种植于I型胶原中的多孔渗透膜；膜为径迹蚀刻聚酯（track-etched polyester, PET）多孔膜，厚度10 μm，孔径3.0 μm，跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）>3000?5000 Ω cm²，渗透率10^?7?10^?8 cm/s。空气通道一进一出并连接培养腔。蛇形液体通道宽100 μm、深200 μm，两入口分别递送培养基和药物，六出口形成六种浓度，注射泵控制流速。样本来源包括患者肿瘤组织/活检组织，如鼻咽癌组织、舌癌组织、HNSCC及局部晚期HNSCC生物样本库；其他ALI培养涉及肾切除患者组织、结直肠癌患者组织等。

研究结果如下。

1. 概述：原文总结HNSCC的解剖来源、危险因素、复发与治疗异质性，指出传统2D培养、动物模型和常规放化疗的局限，并引出类器官、微流控和ALI模型的优势。

2. 头颈部肿瘤类器官与微流控技术：类器官和微流控技术有助于头颈部肿瘤早期诊断并模拟TME中的营养代谢、细胞串扰和血管生成。2.1 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）检测：通过微流控和液体活检，Sharafeldin et al. 开发3D打印微流控微阵列检测超低浓度HNSCC生物标志物；Zoupanou et al. 设计低成本蛇形微通道装置，使口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）患者可独立收集并分析CTCs。2.2 类器官模型建立与基因编辑技术：Haughton et al. 建立HPV阴性HNSCC PDO模型并发现转录特征与临床肿瘤侵袭性相关；Wang et al. 利用NPC组织建立稳定高效体外NPC类器官模型；研究人员创建舌癌类器官库并揭示微小残留病形成机制；Issing et al. 建立头颈类器官生物库以模拟TP53/HPV驱动肿瘤对放疗的个体反应；HNSCC PDOs结合单细胞RNA测序揭示分子亚型和肿瘤内转录异质性（intratumor transcriptional heterogeneity, ITH）；微流控装置可实时监测不同HNSCC PDOs的化疗反应；Fisch et al. 建立局部晚期HNSCC大型活体生物库，验证其用于体外放化疗敏感性筛选；EGFR高表达头颈肿瘤类器官用于研究EGFR靶向光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）反应；Millen et al. 结合CRISPR-Cas9构建PIK3CA E545K突变类器官，明确PIK3CA突变在头颈癌中的预测价值。2.3 肿瘤微环境：代谢、细胞相互作用和血管/淋巴管生成：NPC类器官研究显示放疗抵抗部分归因于缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）激活；Xue et al. 将HPV阳性类器官与癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）共培养，发现CAFs调控HIF-1α通路的核心信号；Hattersley et al. 将微流控整合入HNSCC类器官以模拟体内血管营养供应和代谢废物清除；肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）来源细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）携带miR-21-5p，经HIF-1α通路促进HNSCC血管生成；Lugo-Cintrón et al. 用CAFs建立HNC患者管状淋巴管微流控器官型模型以研究淋巴管生成；Yada et al. 建立原代患者细胞微生理系统，将HNC CAFs与肿瘤球结合研究淋巴微血管转移；Wang et al. 在OSCC类器官中验证CAFs促血管生成能力，并发现N-甲基转移酶家族为CAFs激活关键分子。

3. 类器官与微流控技术在头颈部肿瘤药物及放疗中的应用。3.1 药物与治疗靶点筛选：通过人源OSCC类器官模型确认个性化治疗潜力；Ding et al. 建立三种NPC亚型PDOs，分析基因组突变和转录表达，筛选特异药物-放疗方案：上皮癌亚型对EGFR抑制剂gefitinib敏感（IC₅₀=2.21 μM）且与放疗协同，对紫杉烷耐药；肉瘤样癌亚型上皮-间质转化通路上调，对docetaxel单药敏感（IC₅₀=0.42 μM），与照射无协同且对EGFR阻断不敏感；混合型具有混合分子特征和异质药物反应，优先联合靶向治疗。HNSCC中，p-mTOR表达为HPV阴性患者生存相关潜在生物标志物，并与mTOR抑制剂everolimus反应相关，HNSCC类器官验证p-mTOR表达与everolimus敏感性显著相关。HNC类器官与外周血T细胞共培养模型显示类器官可诱导外周血T细胞分化为肿瘤反应性T细胞；患者来源3D类器官与嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞共培养平台用于评估HNSCC中CAR T细胞毒性活性。3.2 浓度监测与毒性反应监测：微流控浓度梯度发生器可在无显著毒性反应下生成不同药物浓度以筛选最佳剂量；Liao et al. 首次设计适合HNC类器官培养的微腔和双通道浓度梯度发生器，在10–100 μL/min流速下24 h内生成六步线性浓度梯度，浓度波动<3%，校准曲线相关性高（R²=0.9914）；为突破传统线性梯度浓度范围限制，“数学-电路-芯片”模型可提供36种药物浓度条件用于肿瘤类器官联合药物筛选。3.3 放疗疗效及相关药物开发：肿瘤芯片平台可维持精密切割头颈癌用于离体照射，具有个性化治疗潜力；HNSCC PDOs暴露于碳离子和X射线比较显示，碳离子在所有HNSCC PDOs中细胞杀伤效果优于X射线，诱导严重且难修复的DNA损伤并增加细胞凋亡（sub-G₁比例更高），尤其在放射抵抗细胞中；两种辐射均触发G₂/M阻滞。结果提示PDOs可用于研究碳离子效应，碳离子可能克服部分患者对光子的放疗抵抗。

4. ALI肿瘤模型：微环境与药物递送系统。4.1 ALI肿瘤模型模拟微环境：ALI培养顶端暴露空气、基底侧供给培养基，模拟气道等气液交界微环境，可改善类器官存活和成熟；脑类器官ALI培养显示神经元存活和轴突生长改善；ALI用于重建组装类器官血管网络和免疫微环境，并可重现牙、唾液腺和黏膜稳态；原代肠上皮细胞ALI培养呈柱状形态和刷状缘；ALI已用于肺癌、透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）、结直肠癌等肿瘤研究；Zheng et al. 建立ALI头颈癌类器官（ALI head and neck cancer organoid, ALI-HNCO）模型，维持免疫微环境并保留含T淋巴细胞的类器官；对抗PD-1治疗有反应的ALI-HNCO中，CD69表达上调，CD8⁺/CD4⁺ T细胞比例升高，干扰素-γ（interferon-gamma, IFN-γ）产生显著增加，证明PD-1抑制剂可逆转T细胞耗竭并恢复抗肿瘤活性。4.2 致癌病毒与环境污染物：ALI模型可重建天然上皮结构和分化状态，模拟HPV、EBV等病毒感染及病毒驱动致癌微环境，用于研究EBV诱导NPC和宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）向浸润性宫颈癌进展；首个ALI培养自然感染HPV18的外阴上皮内瘤变人细胞系已建立；传统浸没培养无法复制肺动态机械力和真实吸入暴露模式，ALI微流控监测传感器平台可分析PM_2.5刺激后肺癌转移；ALI模型可用于研究吸入化学物对人体呼吸系统疾病的毒性作用。4.3 给药与递送系统开发：鼻或肺递送新型药物气雾剂、凝胶、喷雾或滴剂需要合适体外模型优化鼻腔停留时间、评价黏液纤毛清除并避免局部副作用；ALI模型在黏膜药物及递送研究中重要，囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR）小分子调节剂治疗囊性纤维化是ALI培养药物开发成功案例；ALI气道模型结合气溶胶发生系统用于评估吸入抗癌药的沉积、吸收和扩散；Wang et al. 结合微流控开发高仿生ALI肠道模型，模拟肠道药物载体跨膜和转运过程；ALI条件下粒子暴露后生物效应较浸没培养降低，与较低氧可利用性增加促炎反应有关；药物测试常用浸没培养与ALI条件差异导致颗粒聚集、化学作用改变和结果不可靠，ALI药物应用缺乏标准化是结果可靠性和重复性的主要问题；利用ALI肿瘤模型开发头颈癌药物是未来方向之一。

5. 头颈部肿瘤液-气类器官芯片构建。5.1 ALI模型整合入类器官芯片：头颈部肿瘤类器官芯片需整合类器官组织保真性、微流控动态仿生特性和ALI模型模拟生理微环境优势；芯片为四层模块化设计，第一层为PDMS液体或空气通道进出口层，第四层为玻璃基底，第二、三层分别为空气通道和液体通道，四层经氧等离子键合以保证实时荧光成像的光学透明性；液体通道含类器官培养腔，类器官种植于多孔渗透膜上的I型胶原中，确保空气和液体通道不直接连通；空气通道模拟呼吸道空气环境，可递送空气污染物、香烟或病毒气溶胶等物理化学刺激，重现头颈部肿瘤从慢性损伤到肿瘤发生的完整病理链；空气通道一进一出并连接类器官培养腔。5.2 微流控浓度梯度装置与药物筛选：微流控系统可高效促进芯片上肿瘤球形成，生成高通量悬滴阵列，获得均匀且可独立寻址的肿瘤球；基于流体动力学的微尺度几何结构可精确捕获细胞并培养尺寸高度均一的肿瘤球；系统支持连续灌注并对营养、氧和给药提供时空控制，维持长期肿瘤生长和精确建模；通过调整流体通道长度可生成空间浓度梯度，均匀宽度通道改变入口至出口长度以调控溶质分布；注射泵精确控制流速，分别引入药物溶液和培养基；蛇形液体通道宽100 μm、深200 μm，两个液体入口分别添加培养基和药物，六个出口生成六种浓度；长通道延长混合时间产生较高浓度，短通道维持较低药物浓度；六个平行类器官培养腔用于筛选药物有效浓度，实现快速高通量药物筛选和实时、可视化、定量监测动态肿瘤生物信号。5.3 未来挑战：ALI-类器官微流控芯片仍面临制造技术和基底材料限制，PDMS易吸收药物化合物并破坏药物浓度梯度精度，芯片密封操作不一致影响实验稳定性；共培养系统不能完全重现天然TME，虽可共培养肿瘤细胞、CAFs和部分免疫亚群，但无法重建头颈组织完整黏膜特异TME；芯片气体通道也不能模拟生理条件下上呼吸消化道多种危险因素长期联合暴露所致慢性组织损伤；培养和检测标准化方案仍缺乏，不同实验室芯片尺寸、通道配置和类器官制备方案差异导致重复性差，相关检测成本高阻碍常规实验室普及；未来可与人工智能（artificial intelligence, AI）和荧光微滴应用等新兴技术整合，开发更高效、更仿生模型。

讨论部分总结：原文讨论部分主要集中于未来挑战，指出ALI-类器官微流控芯片在仿生建模和高通量药物筛选中具有优势，但大规模临床转化受限于制造技术、基底材料、TME完整重建、慢性多危险因素联合暴露模拟、标准化方案缺失和成本问题；未来需与AI、荧光微滴等技术整合。

研究结论部分翻译：在过去的几十年中，研究人员投入了大量努力，以阐明基于肿瘤模型的功能特征及其临床转化。本工作设计并开发了用于HNC的微流控类器官芯片。ALI模型的生理模拟已成为开发仿生肿瘤模型的关键研究方向。通过整合ALI模型，该集成微流控类器官平台解决了传统2D细胞培养和动物模型在模拟HNC病理特征和药物反应方面的固有局限性，并为探索HNC肿瘤发生机制、识别预测性生物标志物、评估放化疗疗效和开发个性化治疗方案提供了新的技术工具。