基于细胞膜色谱(CMC)鉴定的Schisandrin B (SchB)靶向TLR2并阻断TLR2与TLR1/TLR6异二聚化改善PGN诱导免疫性结肠炎和DSS触发溃疡性结肠炎

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Schisandrin B identified by CMC ameliorates PGN-induced immune colitis and DSS-triggered ulcerative colitis by targeting TLR2 and blocking TLR2 heterodimerization

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种由复杂相互作用导致的慢性肠道炎症性疾病。当前临床治疗疗效有限，IBD对全球健康构成日益严峻的挑战。对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的分析、IBD患者临床样本以及葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的小鼠结肠炎模型均一致显示，Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）在转录和蛋白水平表达升高，提示其参与IBD发病机制，并突出其作为治疗靶点的潜力。既往研究表明，五味子乙素（Schisandrin B, SchB）可保护DSS诱导的结肠炎，但其是否直接靶向TLR2等上游免疫受体，以及除已知抗炎作用外还存在哪些额外机制，仍有待探索。在本研究中，研究人员利用细胞膜色谱（cell membrane chromatography, CMC）鉴定SchB为中度TLR2配体。通过直接结合TLR2并抑制其与Toll样受体1（Toll-like receptor 1, TLR1）或Toll样受体6（Toll-like receptor 6, TLR6）的异二聚化，SchB在炎症细胞模型中发挥显著抗炎和治疗作用，并改善小鼠DSS诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和肽聚糖（peptidoglycan, PGN）诱导的免疫性结肠炎。SchB抑制TLR2信号并激活sequestosome 1（p62/SQSTM1）/Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）/核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）轴，同时发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡作用并增强肠道屏障完整性。这些发现为支持SchB作为IBD有前景的治疗候选药物提供了分子机制的新证据。

该论文发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》，作者包括Mingzhen Zhang、Litao Wu、Zizhen Guo、Chunyan Yin、Rong Zhao、Yingchao Li、Kaikai Lu、Dongmin Li、Wenlong Wang、Luyun Yang、Haoyun Bai、Yakun Huang、Quan Zhang、Shengli Han、Xiaona Cheng、Jiafu Liang、Kexin Cheng。研究围绕炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）中Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）的上游靶向治疗展开。

IBD包括克罗恩病（Crohn’s disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC），是一种以肠屏障功能障碍、持续炎症和过度组织损伤为特征的慢性复发缓解性疾病。近年来其全球发病率和患病率上升，临床现有治疗疗效有限且存在副作用。免疫系统功能异常，尤其Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）介导的信号，是IBD发病的关键机制之一。活动性UC患者中TLR2表达升高，TLR2及其下游信号被视为潜在治疗靶点，但目前尚无有效或获批的TLR2靶向药物。天然产物因结构多样和多靶点潜力受到关注。SchB（Schisandrin B）是自Fructus Schisandrae（FS，五味子果实）分离的二苯并环辛二烯木脂素，具有抗炎、抗氧化、神经保护、抗癌、肝保护和心脏保护等活性。既往研究显示SchB可保护DSS诱导的结肠炎，但其是否直接靶向TLR2等上游免疫受体，及其在IBD中的具体机制尚未充分阐明。因此，研究人员采用CMC筛选并系统评价SchB靶向TLR2及其治疗结肠炎的机制。

关键技术方法概述：样本来源包括21例IBD患者（CD n=5，UC n=16）和11例健康供体的结肠活检；动物包括C57BL/6J、BALB/c及Tlr2^?/?小鼠。主要技术包括TLR2/CMC筛选、前沿分析、竞争置换、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）、分子对接、药物亲和响应靶稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）、细胞热转变分析（cellular thermal shift assay, CETSA）、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、免疫荧光共定位、流式细胞术、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、逆转录定量实时PCR（reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR）、Western blot、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色及免疫组化，并建立DSS诱导UC模型和PGN诱导TLR2依赖性免疫结肠炎模型。

研究结果如下：

3.1 TLR2 is up-regulated in human IBD samples and DSS mouse models（TLR2在人IBD样本和DSS小鼠模型中上调）：通过GEO数据集、21例IBD患者和11例健康供体结肠活检及DSS小鼠模型，发现TLR2在转录和蛋白水平均升高；DSS小鼠出现体重下降、疾病活动指数升高、结肠缩短和组织病理损伤，且Tlr2 mRNA和TLR2蛋白升高。结论为TLR2表达与炎症性疾病正相关。

3.2 SchB directly binds to TLR2（SchB直接结合TLR2）：研究人员在HEK293T细胞中过表达人TLR2并建立TLR2/CMC柱，筛选中药小分子库。SchB在TLR2/CMC柱上保留时间显著延长，前沿分析得到K_D=6.372×10^?6 M，SPR得到K_D=54.4×10^?6 M，提示微摩尔级结合。竞争置换显示SchB与C29结合位点不同；分子对接预测SchB与TLR2形成氢键；DARTS和CETSA显示SchB增强TLR2蛋白酶抗性和热稳定性，而F322A/L324A/F325A/D327A突变削弱该保护，提示F322/L324/F325/D327为核心结合口袋。

3.3 SchB directly targets to TLR2 and inhibits its heterodimerization with TLR1 or TLR6 to mediate cellular immune responses（SchB直接靶向TLR2并抑制其与TLR1或TLR6异二聚化以介导细胞免疫应答）：SchB抑制P3C和P2C诱导的Tnf、Il6转录及NF-κB活化；TLR2敲低后P3C/P2C反应降低，SchB无进一步抑制；TLR2过表达细胞中SchB逆转IL6和TNF转录。Co-IP和免疫荧光显示SchB破坏TLR2/1和TLR2/6异二聚化及MyD88招募。

3.4 SchB ameliorates inflammation by inhibiting the TLR2/NF-κB and MAPK signaling pathways（SchB通过抑制TLR2/NF-κB和MAPK信号通路改善炎症）：在RAW 264.7、PMA分化THP-1、Caco-2和NCM460细胞中，P3C+P2C共刺激上调Tlr2、Tnf、Il6、Il1b；SchB中高剂量抑制强于C29，并降低TNF-α、IL-6、IL-1β分泌。Western blot显示SchB抑制MyD88、IKKα/β、IκBα、p65磷酸化及ERK、JNK、p38磷酸化。SchB不直接结合TLR4，但可抑制LPS诱导的Tnf和Il6。

3.5 SchB attenuates oxidative damage and apoptosis by inhibiting the TLR2/MyD88 signaling pathway（SchB通过抑制TLR2/MyD88信号通路减轻氧化损伤和凋亡）：SchB下调COX2、iNOS并上调SOD2，激活p62/Nrf2/Keap1轴，上调p62、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLC、GCLM，降低Keap1，促进Nrf2核积累；下调p-STAT1、p53、Bax、Bad、caspase-3，上调Bcl-2，减少凋亡；恢复TJP1、TJP2、OCLN、MUC2、CLDN1、CLDN2、CLDN4及ZO-1、E-cadherin、Occludin、β-catenin。结论为SchB具有抗氧化、抗凋亡和屏障修复作用。

3.6 SchB alleviates DSS-induced UC in mice model（SchB缓解小鼠DSS诱导UC）：SchB 50 mg/kg连续7天安全性良好。DSS模型给予C29、5-ASA及SchB低、中、高剂量；SchB改善体重、疾病活动指数、便血腹泻和结肠镜评分，防止结肠缩短，改善H&E病理，恢复ZO-1和MUC2及屏障相关基因，降低脾指数，并减轻肝损伤和血脂异常。

3.7 SchB alleviates DSS-induced UC by inhibiting the TLR2/NF-κΒ/MAPK signaling pathway and activating Nrf2 to mitigate inflammation and oxidative stress（SchB通过抑制TLR2/NF-κΒ/MAPK信号通路并激活Nrf2缓解炎症和氧化应激）：DSS模型中，SchB剂量依赖性降低血清TNF-α和IL-6，抑制结肠Tlr2、Tnf、Il6、Il1b，降低Cox2、Inos、MDA、MPO，升高CAT和GSH-PX；Western blot显示抑制TLR2/MyD88、p-p65、p-IκBα、p-P38、p-ERK、p-JNK，并激活Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLM、GCLC、SOD2。

3.8 SchB ameliorates TLR2-dependent PGN-induced immune colitis via suppression of the TLR2 signaling cascade（SchB通过抑制TLR2信号级联改善TLR2依赖性PGN诱导免疫结肠炎）：PGN诱导TLR2依赖性免疫结肠炎。Tlr2^?/?小鼠体重下降较轻，SchB减轻野生型小鼠体重下降。SchB降低脾指数、血清TNF-α和IL-6，改善组织学，抑制Tlr2、Tnf、Il6，上调Cdh1、Cldn1、Ocln、Tjp1、Tjp2，下调Cldn2，调节Bcl2、Bax、Bad及AST/ALT。Tlr2^?/?及联合SchB处理效果更优。

讨论部分总结：IBD发病涉及过度氧化应激、免疫失调和肠道菌群失调，现有治疗受限，TLR2及其下游效应分子成为有希望的治疗靶点。CMC可保持受体天然膜环境，桥接体外与体内条件。该研究首次提供SchB直接结合TLR2的证据；CMC与SPR所得K_D差异可能源于TLR2真核与原核表达、膜环境保留、蛋白固定化、缓冲液和检测方式不同，但均支持微摩尔级结合。DARTS和CETSA进一步验证直接结合，并确定F322/L324/F325/D327为核心结合口袋。细胞水平TLR2敲低和过表达实验支持SchB与TLR2相互作用，阻止MyD88依赖的促炎信号；Co-IP和免疫荧光共定位表明SchB干扰TLR2/1和TLR2/6异二聚化。DSS和PGN模型验证其在体内抑制TLR2/NF-κB/MAPK、激活p62/Nrf2/Keap1、减少凋亡、增强紧密连接和屏障完整性。局限性包括仅评价急性DSS模型，需慢性模型验证；临床队列较小且未分层，需更大样本；SchB药代动力学中C_max和AUC_0–∞较好，未来需探索提高稳定性、生物利用度和结肠靶向释放的递送策略。

研究结论翻译：总之，在人IBD患者和DSS诱导的小鼠结肠炎模型中观察到TLR2表达上调，提示TLR2可能代表IBD治疗的潜在治疗靶点。本研究利用CMC高效筛选中药来源小分子，鉴定SchB为膜受体TLR2的结合物。SchB特异性结合TLR2，通过阻断TLR2/1和TLR2/6异二聚化抑制TLR2活性，F322/L324/F325/D327区域作为其核心结合口袋。在DSS诱导结肠炎模型和PGN介导结肠炎模型中，SchB通过抑制TLR2/NF-κB/MAPK信号级联缓解疾病进展。这些变化共同与凋亡减少和肠道屏障完整性改善相关。综上，研究人员的发现提示SchB作为TLR2介导先天免疫应答直接调节剂的一种此前未被认识的作用机制，首次揭示其在结肠炎治疗中的上游靶向机制。此外，本工作建立的基于CMC的筛选策略为发现靶向TLR2的天然产物提供了可行平台。尽管SchB用于人类IBD的转化潜力仍需在临床环境中评估，这些结果将SchB定位为IBD治疗背景下进一步研究的候选物。