厚脉络膜型息肉状脉络膜血管病变(Pachy PCV)血管生成机制解析：脉络膜循环高压经FSS-AS/HIF-1通路激活EDN1/EDNRA轴

《iMeta》：Dissecting the angiogenic mechanism of pachychoroid polypoidal choroidal vasculopathy

　　

息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)是新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular age-related macular degeneration, AMD)的一种独特变异型，也是老年人视力丧失的主要原因，但其发病机制仍知之甚少。厚脉络膜型PCV(pachychoroid PCV)是一种亚型，特征为治疗反应差、典型AMD特征极少以及脉络膜血管扩张。研究人员利用多中心PCV队列，进行了血浆多组学分析，并在该亚型中鉴定到流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis, FSS-AS)信号通路的富集。厚脉络膜表型连同FSS-AS富集，提示脉络膜血流动力学改变参与其发病机制。通过在小鼠中诱导脉络膜循环高压(choroidal circulatory hypertension, CCH)，研究人员首次重现了厚脉络膜型PCV的典型眼部病变。单细胞测序鉴定了这些血管生成病变的细胞来源，并提示内皮素-1(endothelin-1, EDN1)是关键效应分子。减轻脉络膜高压、降低EDN1表达或药理学阻断内皮素受体A(endothelin receptor A, EDNRA，为EDN1的受体)，可预防病变形成。体外实验中，扰动流体剪切应力上调脉络膜内皮细胞中的EDN1，并通过EDNRA促进病理性重塑和血管生成。总之，研究人员的发现定义了一个致病级联：CCH诱导异常血流动力学(流体剪切应力紊乱)，并通过EDN1/EDNRA轴驱动血管生成，为厚脉络膜型PCV提供了机制见解并确定了潜在治疗靶点。

息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)是脉络膜血管异常，以眼底橘红色息肉样病灶和分支新生血管网(branching neovascular networks, BNNs)为特征，在亚洲人群尤其常见，约影响中国一般人群0.3%。PCV可导致严重视力损害甚至盲，主要因出血性色素上皮脱离(pigment epithelial detachment, PED)、大量视网膜下出血(subretinal hemorrhage, SRH)和突破性玻璃体出血(vitreous hemorrhage, VH)等严重并发症。自1990年首次描述以来，其发病机制仍不清楚。抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)眼内注射为一线治疗，但费用高、长期疗效常不理想。基于中心凹下脉络膜厚度(subfoveal choroidal thickness, SFCT)双峰分布，PCV被分为厚脉络膜型PCV(pachychoroid PCV, Pachy PCV)和非厚脉络膜型PCV(non-pachychoroid PCV, Non-pachy PCV)。Pachy PCV以脉络膜增厚、涡静脉扩张充盈、最大血管直径比增加、脉络膜血管指数升高和脉络膜血管高通透性(choroidal vascular hyperpermeability, CVH)增加为特征，患者更年轻、出血并发症更重，术中息肉样病灶再出血常见，需硅油甚至全氟碳液止血。基于临床观察，研究人员假设脉络膜循环高压(choroidal circulatory hypertension, CCH)可能是Pachy PCV关键致病驱动因素，但既有研究主要关注形态特征，机制未明。为此，研究人员通过前瞻性多中心队列、多组学、动物模型和体内外验证，提出Pachy PCV新定义并解析CCH经异常血流动力学及EDN1/EDNRA轴驱动血管生成的机制。研究提示Pachy PCV对anti-VEGF反应较差；建立涡静脉结扎CCH小鼠模型，首次重现Pachy PCV样息肉样病灶；确定EDN1为关键效应分子，干预CCH/EDN1/EDNRA可减轻病变，提供潜在治疗靶点。论文发表在《iMeta》。

研究方法概述：研究基于中国43家医疗中心2017年5月至2023年5月招募的716例治疗初治PCV眼，来自多中心PCV队列，接受标准化“3+pro re nata”(3+PRN)anti-VEGF方案并随访12个月。血浆多组学纳入40例Pachy PCV、31例Non-pachy PCV和35例年龄匹配健康对照，进行蛋白质组学、非靶向代谢组学。动物实验使用健康C57BL/6小鼠和Edn1^+/? C57BL/6小鼠，结扎上颞和上鼻象限两支涡静脉诱导CCH，并设巩膜开窗、EDNRA拮抗剂atrasentan灌胃及载体对照。采用扫频源OCT、FFA/ICGA、H&E、荧光染色和激光共聚焦；对RPE-脉络膜-巩膜复合体行单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)，去除CD45⁺细胞并富集CD31⁺内皮细胞。体外以层流(6 dyn/cm²)和振荡剪切应力(oscillatory shear stress, OSS，±6 dyn/cm²)处理小鼠脉络膜内皮细胞(mouse choroidal endothelial cells, mCECs)。

基于多中心数据集的PCV分类(Classification of PCV based on the multicenter dataset)。研究人员分析716例治疗初治PCV眼，来自43家中心。与anti-VEGF良好应答组276眼相比，不良应答组440眼年龄更轻、SFCT更大、脉络膜pachyvessels比例更高、AMD样特征更少，随访中大量出血比例更高。多变量logistic回归显示脉络膜pachyvessels、大量出血和SFCT是anti-VEGF不良应答显著预测因素。研究人员据此提出Pachy PCV定义：满足两个主要标准或一个主要标准加两个次要标准。主要标准为SFCT≥300 μm和存在脉络膜pachyvessels；次要标准为年龄≤66岁和无AMD样特征。未满足者为Non-pachy PCV。该标准敏感性91.1%、特异性90.2%；1000次bootstrap内部验证显示C-index为0.875，乐观校正后0.870，校准平均绝对误差0.043。

蛋白质组学和代谢组学揭示Pachy PCV特异性信号通路(Proteomics and metabolomics revealed signaling pathways specific to Pachy PCV)。对Pachy PCV、Non-pachy PCV和健康对照血浆分析，鉴定98个Pachy PCV特异性蛋白，富集于信号转导、刺激反应、缺氧反应、生长增殖调控、炎症反应、细胞黏附迁移。除VEGF、MAPK、Rap1、PI3K-Akt通路外，FSS-AS通路和HIF-1通路显著。代谢组鉴定37个Pachy PCV特异性代谢物，FSS-AS(如peroxynitrite)和HIF-1(如pyruvic acid、Fe²⁺)通路也升高。蛋白质组和代谢组相关分析显示FSS-AS和HIF-1通路一致上调。

小鼠模型建立与影像评估(Mouse model establishment and imaging assessment)。研究人员通过结扎健康C57BL/6小鼠四支涡静脉中的两支，诱导Pachy PCV样眼部改变。ICGA显示涡静脉扩张和息肉样病灶；OCT显示双层征、拇指样突起、浆液性PED和脉络膜增厚；H&E显示脉络膜血管扩张及源于脉络膜血管的新生血管。荧光染色和激光共聚焦在RPE-脉络膜复合体中确认息肉样病灶和BNN样结构，IB4与P-Selectin双染提示其血管性质。

通过scRNA-seq鉴定Pachy PCV小鼠模型独特血管内皮细胞(Identification of unique vascular endothelial cells in pachy PCV mouse model via scRNA-seq)。对RPE-脉络膜-巩膜复合体scRNA-seq，鉴定动脉、静脉、毛细血管和淋巴四种主要内皮细胞，并发现独特内皮细胞亚型PB-CNV，表达胶原相关基因如Col4a1、Col4a2和激活相关基因如Sparc、Sparcl1。拟时序分析提示PB-CNV祖细胞可能来自活性后毛细血管静脉(active posterior-capillary vein, active PC vein)，向未成熟和成熟PB-CNV进展；应激损伤、细胞骨架、炎症和纤维化相关基因逐渐上调。SELP选为PB-CNV生物标志物，IB4作为mCECs标志物。

鉴定Edn1为active PC vein关键致病靶基因(Identification of Edn1 as a key pathogenic target gene in the active PC vein)。对active PC vein上调基因构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein–protein interaction, PPI)网络，FSS-AS和HIF-1通路变化最显著。拓扑参数初步鉴定15个枢纽基因，包括Edn1、Cdkn1a、Hspa5等。KEGG富集和分子复合物检测(molecular complex detection, MCODE)子网络分析进一步证实两通路富集。Edn1被鉴定为FSS-AS和HIF-1通路潜在分子连接点，Cdkn1a、Itgav、Hsp90aa1、Sqstm1也为调控网络关键贡献者。

体外CCH诱导的振荡剪切应力通过EDN1/EDNRA轴发挥作用(In vitro effects of CCH-induced oscillatory shear stress mediated via the EDN1/EDNRA axis)。研究人员用OSS模拟CCH异常血流。免疫荧光评估F-actin和VE-cadherin；qPCR筛选38个候选基因，确定EDN1为关键调节因子。活细胞成像显示OSS下mCECs向外扩展和随机游走样迁移更快，Edn1敲低显著减弱。Edn1敲低抑制OSS诱导表型，包括增殖减少、迁移和侵袭增强、内皮管形成增加，并伴随c-Casp3、ANG-1、MMP9、IL-6升高和ZO-1降低；Edn1重新表达恢复这些效应。共免疫沉淀显示EDN1与EDNRA物理互作；Ednra敲低可表型模拟Edn1敲低。

体内验证CCH和EDN1/EDNRA轴作用(In vivo validation of the role of CCH and EDN1/EDNRA axis)。研究人员构建涡静脉结扎伴巩膜开窗、EDNRA拮抗剂给药、Edn1^+/?等比较模型。仅结扎组ICGA息肉样病灶比例最高(23眼11眼，47.8%)，平均每眼5.96个病灶，最大涡静脉直径1536.6±119.1 μm，脉络膜厚度58.20±3.56 μm，高于其他组。巩膜开窗、EDNRA拮抗剂和Edn1^+/?均减轻息肉样病灶形成、涡静脉扩张和脉络膜增厚；载体对照与仅结扎组相似。Edn1^+/?小鼠单侧结扎后双眼均未发生息肉样病灶，尽管结扎眼涡静脉直径和脉络膜厚度增加。

讨论部分指出，该研究通过整合临床表型、多组学、小鼠模型、体内外验证，描绘Pachy PCV致病机制。基于多中心PCV数据集提出预后导向分类，将厚脉络膜特征作为识别Pachy PCV的关键标准，且与Non-pachy PCV相比anti-VEGF应答更差。血浆多组学支持分类的生物学相关性。CCH和紊乱流体剪切应力模型重现Pachy PCV标志病理。PB-CNV起源于active PC vein成分，EDN1为中心分子调节因子。体外证实扰动流体剪切应力上调mCECs中EDN1，EDN1/EDNRA驱动血管病理性重塑和炎症激活，促进病理性血管生成；体内Edn1单倍不足、EDNRA药理抑制或巩膜开窗机械缓解CCH均减轻Pachy PCV形成。讨论还强调“pachychoroid”描述脉络膜厚度异常增加，单用SFCT不足，需结合SFCT、pachyvessels、无AMD样特征和年轻年龄。大量出血未纳入诊断标准，因其被视为CCH后果而非内在结构生物标志或起始因素。内部验证显示分类稳定。涡静脉结扎模型首次成功诱导息肉样病灶和BNNs，较其他基于基因过表达且无脉络膜改变的模型更贴近脉络膜病理生理。PB-CNV可能起源于active PC vein，与既往临床病理观察一致。FSS-AS和HIF-1通路与人类血浆组学一致，FSS尤其关键。EDN1为21氨基酸肽，由内皮细胞产生，通过EDNRA调节增殖、生长、血管张力和炎症，激活VEGF信号并促进血管生成。局限包括队列以亚洲人为主；PB-CNV起源经拟时序推断，需谱系追踪；血浆未检测到循环EDN1显著改变，可能因EDN1旁分泌且快速分解，研究使用血浆而非眼内液，存在局限；真实世界多中心残留偏倚、未外部验证；小鼠无黄斑且涡静脉血流单向，可能限制直接转化；EDN1抑制仍需人体验证。

研究结论翻译：总之，该研究提供多尺度证据支持Pachy PCV中的致病级联，其中CCH诱导剪切应力紊乱，激活FSS-AS和HIF-1信号通路，并通过EDN1/EDNRA轴破坏脉络膜内皮细胞(choroidal endothelial cell, CEC)稳态，最终促进病理性血管生成和Pachy PCV发生。这些发现阐明了一种既往未被充分认识的Pachy PCV血流动力学-分子机制，并强调未来干预的潜在治疗靶点。