《International Journal of Cancer》：Human Protein Biomarkers Outperform Bacterial Proteins in Colorectal Cancer Detection
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结直肠癌通常从前癌性腺瘤样病变（包括晚期腺瘤）发展而来，这一过程伴随着一系列致癌分子改变。已知患有晚期腺瘤和结直肠癌的个体与对照组相比，其肠道菌群组成和粪便蛋白质组存在差异，这为生物标志物的发现提供了机会。本研究旨在评估细菌蛋白作为非侵入性生物标志物的潜力，无
结直肠癌通常从前癌性腺瘤样病变（包括晚期腺瘤）发展而来，这一过程伴随着一系列致癌分子改变。已知患有晚期腺瘤和结直肠癌的个体与对照组相比，其肠道菌群组成和粪便蛋白质组存在差异，这为生物标志物的发现提供了机会。本研究旨在评估细菌蛋白作为非侵入性生物标志物的潜力，无论是单独使用还是与人类蛋白联合使用。为此，研究人员分析了来自结肠镜对照人群的两个粪便样本集：样本集1（CRC：12例，AA：10例，对照：20例）和样本集2（CRC：79例，AA：40例，对照：129例）。采用基于质谱的蛋白质组学对两个系列粪便样本中的蛋白质进行鉴定和定量。利用重叠的差异蛋白（p?<?0.05）通过逻辑回归和留一法交叉验证建立生物标志物组合。共评估了三个生物标志物组合：一个包含细菌蛋白，一个结合人类和细菌蛋白，另一个仅含人类蛋白。在两个样本集中共鉴定出5400种重叠蛋白。对于结直肠癌和晚期腺瘤的联合检测，人类-细菌联合组合和仅人类蛋白组合取得了最佳性能（AUCs 0.88–0.90；灵敏度56%–68%），超过了单独的人类血红蛋白（AUCs 0.78–0.86；灵敏度49%）和细菌蛋白组合（AUCs 0.67–0.75；灵敏度17%–46%）。总之，人类蛋白生物标志物组合在诊断性能上优于细菌蛋白，尤其是在CRC检测方面，这表明在该背景下粪便宏蛋白质组学的诊断价值主要由宿主来源的蛋白驱动。
研究背景与目的
结直肠癌是全球第二大癌症死亡原因，早期发现对改善预后至关重要。目前，基于粪便免疫化学检测的筛查方案虽对CRC敏感性高，但对癌前病变——晚期腺瘤的检出率有限（仅约25%），这凸显了开发更优检测策略的必要性。已有研究表明，粪便中的人类蛋白标志物可提升筛查效果，而肠道微生物组在腺瘤-癌序列中的作用也备受关注。然而，细菌蛋白能否作为补充标志物尚不明确。为此，研究人员开展了一项基于粪便宏蛋白质组学的双样本集研究，旨在系统比较人类蛋白与细菌蛋白在检测AA和CRC中的诊断价值，并评估两者联合使用的潜在增益。
研究方法与技术路线
研究人员使用了两个独立的前瞻性结肠镜对照人群样本集：样本集1（荷兰三家医院，2016-2019年，n=53）和样本集2（荷兰与德国多中心，2005-2012年，n=291）。采用液相色谱-串联质谱技术对粪便上清液进行蛋白质组学分析，数据经ProteoWizard转换后，使用MSFragger软件在包含人类RefSeq蛋白、355种胃肠道细菌蛋白组及反向诱饵库的复合数据库中进行搜库鉴定。通过Trans-Proteomics Pipeline进行肽段与蛋白推断，以1%假发现率为阈值过滤。选取在两个数据集中均显著差异表达的蛋白（p≤0.05，每组至少30%样本中可检测到），采用逻辑回归对所有可能的四蛋白组合进行穷举搜索，并在样本集2中使用留一法交叉验证筛选最优分类器（固定特异性95%），最终在样本集1中验证。以曲线下面积和95%特异性下的灵敏度评估性能，并与血红蛋白A1进行比较。
研究结果
3.2 生物标志物组合的构建：在两个数据集中共鉴定出5400种重叠蛋白（530种人类蛋白，4870种细菌蛋白）。针对CRC对比对照、AA对比对照以及CRC+AA联合对比对照三种诊断场景，分别构建了细菌蛋白组合、人类蛋白组合及人-菌联合组合。
3.2.1 CRC检测性能：共有44种重叠人类蛋白和20种重叠细菌蛋白用于组合构建。最佳细菌组合（支链氨基酸转氨酶、TonB连接外膜蛋白、GGGtGRT蛋白、OmpA家族蛋白）在数据集1和2中AUC分别为0.85和0.75，灵敏度为50%和30%。最佳人类组合（血红蛋白亚基δ、间α胰蛋白酶抑制剂重链H4、血红蛋白亚基β、α-2-巨球蛋白）表现更优。人-菌联合组合（HBD、A2M、血浆蛋白酶C1抑制剂、丁酸弧菌假设蛋白）在数据集2中AUC达0.93，灵敏度72%，显著优于血红蛋白单独检测（AUC 0.88，灵敏度65%）。DeLong检验显示人类组合和联合组合的总体AUC显著高于细菌组合。
3.2.2 AA检测性能：仅有7种重叠差异蛋白（均为人类蛋白），无法构建细菌蛋白组合。最佳人类组合（HBB、触珠蛋白、α-2-抗纤溶酶、乳胶素）在数据集1中AUC为0.78（灵敏度50%），优于血红蛋白（AUC 0.81但灵敏度仅30%）；在数据集2中AUC为0.66（灵敏度18%），同样优于血红蛋白（AUC 0.58）。
3.2.3 CRC+AA联合检测性能：共45种重叠差异蛋白（32种人类，13种细菌）。细菌组合AUC为0.75和0.68，灵敏度仅46%和17%。人类组合（HP、A2M、唾液酸O-乙酰酯酶、过氧化氢酶）AUC达0.90和0.82，灵敏度68%和60%。人-菌联合组合（HP、HBB、支链氨基酸转氨酶、GGGtGRT蛋白）AUC为0.88和0.83，灵敏度68%和56%。所有人类或联合组合均优于血红蛋白单独检测（AUC 0.86和0.78，灵敏度45%和49%）。部分AUC分析显示，在数据集2中人类组合和联合组合显著优于细菌组合，且联合组合优于血红蛋白。
3.2.4 纳入非进展期腺瘤的影响：将非进展期腺瘤纳入对照组后重新评估，仅观察到微小性能变化，表明主要结论稳健。
讨论与结论
讨论部分：研究发现，尽管鉴定的细菌蛋白数量远超人类蛋白，但其跨数据集的一致性差，这可能源于肠道微生物组的高度个体间和环境变异性，以及细菌蛋白较低的质谱检测丰度导致量化不稳定。既往基于DNA的微生物组分类器研究报道的AUC范围与本研究相似（0.70-0.85），但灵敏度参差不齐。本研究中细菌蛋白组合对AA检测无贡献，进一步证实了微生物标志物在腺瘤识别方面的局限性。相比之下，人类蛋白直接反映肿瘤相关宿主过程（如出血、急性期反应、氧化应激代谢重编程），因而表现出更强的区分能力。值得注意的是，入选的最佳细菌蛋白（如TonB连接外膜蛋白、延伸因子Tu、支链氨基酸转氨酶）涉及铁代谢、蛋白质合成和氨基酸代谢等与CRC发病机制相关的功能通路，但这些信号可能仅是间接反映肿瘤微环境的变化。
结论部分：在粪便宏蛋白质组学数据中，宿主来源的蛋白是诊断性能的主要驱动力，尤其对于CRC检测；而微生物组来源的信号对CRC和AA的检测附加价值有限。尽管对AA的诊断性能仍然受限，但人类蛋白在所有分析中始终优于细菌蛋白。未来，细菌蛋白质组或许更适合作为探索肠道菌群与宿主在CRC发展过程中功能性相互作用的资源，而非直接的诊断来源。
