《Food Science & Nutrition》：Conjugation of Coffee Phenolics With Milk Bioactive Peptides: Characterization of Coffee and Apple Phenolics and Evaluation of Polyphenol Oxidase as a Natural Biocatalyst
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本研究旨在表征生咖啡豆与苹果汁中的酚类化合物，并评估不同苹果品种来源的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）作为天然生物催化剂用于酚类物质与乳源生物活性肽共价结合的可行性。通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC–MS）进行酚类物质谱分析，结果
本研究旨在表征生咖啡豆与苹果汁中的酚类化合物，并评估不同苹果品种来源的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）作为天然生物催化剂用于酚类物质与乳源生物活性肽共价结合的可行性。通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC–MS）进行酚类物质谱分析，结果表明绿原酸类（chlorogenic acids）是生咖啡豆中的主要酚类化合物，其中5-O-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）占主导地位。在供试苹果品种中，Braeburn品种表现出最高的PPO活性（6262.4 ± 462.6 U/L）及适中的绿原酸含量。研究人员在碱性条件及PPO介导条件下对BioZate1（BZ1）与糖巨肽（Glycomacropeptide，GMP）进行了修饰。24小时后观察到游离CQA水平显著降低，尤其在碱性处理组中更为明显。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）与反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析结果与肽-CQA结合物的形成相一致，其中碱性修饰获得最高的结合酚类含量（ABZ1为14.95 μg/mg蛋白，AGMP为10.14 μg/mg蛋白）。上述研究结果表明，苹果来源的PPO在测试条件下可促进咖啡酚类物质的转化，支持其作为肽-酚类修饰天然生物催化系统的潜力。然而，与碱性处理相比，PPO介导处理中CQA结合组分的含量较低，且缺乏热灭活PPO对照，这限制了对所观察到的修饰作用是否特异归因于PPO或确证共价结合属性的明确判定。因此，仍需进一步的结构研究以确定肽-酚类相互作用的性质及特异性位点。此外，所开发的修饰系统可为后续研究修饰肽的功能特性及技术特性提供基础。
一、研究背景与问题提出
咖啡属于茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea），包含100余个物种，其中小粒咖啡（Coffea arabica）和中粒咖啡（Coffea robusta）是商业上最重要的两个品种。咖啡不仅是全球消费量最大的饮料之一，也是富含生物活性化合物的复杂天然基质，包括酚酸、二萜类和生物碱等。其中，绿原酸类（chlorogenic acids，CGAs）——咖啡酸与奎宁酸的酯类——是咖啡中最主要的多酚类化合物，可占咖啡豆干重的12%。这些酚类物质在决定咖啡抗氧化潜力方面发挥关键作用，并与多种有益生理效应相关，包括葡萄糖代谢调节、氧化应激保护、抗氧化、抗炎及抗癌特性。其中主要成分5-O-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）反应活性尤为突出，可发生氧化和异构化，形成生物活性衍生物或醌类中间体，进而与蛋白质和肽等生物大分子发生共价相互作用。
在食品化学领域，酚类-蛋白质相互作用因其增强蛋白质功能特性的能力而受到广泛关注，这一特性是功能食品应用的关键参数。然而，目前用于驱动此类修饰的化学氧化系统通常依赖非选择性氧化剂或高pH条件，可能导致不良副反应、氨基酸完整性损失或对结合物形成控制不佳。这些缺陷促使研究者寻求能够实现选择性、环境友好型酚类共价结合的自然酶促途径。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一种含铜酶，广泛分布于苹果、香蕉和蘑菇等植物组织中，可催化邻二酚（如绿原酸或儿茶酚）的两电子氧化生成相应的邻醌，后者作为亲电体可与赖氨酸、半胱氨酸、色氨酸等亲核氨基酸残基反应形成共价加合物。
尽管此前已有关于绿原酸-蛋白质相互作用（采用碱性和酶促氧化系统）的报道，但针对咖啡来源绿原酸与乳源生物活性肽（其在分子大小、氨基酸可及性和反应活性方面与天然蛋白质存在显著差异）结合的研究仍然匮乏。此外，多数已发表研究采用纯化的商业绿原酸和商业氧化酶。本研究作为一项综合性研究的第一阶段，旨在利用苹果汁来源的多酚氧化酶作为天然生物催化剂，实现咖啡来源绿原酸与乳源生物活性肽BioZate1（BZ1）和糖巨肽（Glycomacropeptide，GMP）的结合。具体目标包括：利用HPLC–MS表征生咖啡豆和苹果汁的酚类组成；评估不同苹果品种间的PPO活性以确定最佳生物催化剂来源；评估储存条件对PPO稳定性和活性的影响。该研究策略为开发用于功能食品应用的肽-酚类结合物提供了更贴近真实食品体系的途径。
二、主要技术方法
研究人员采用多项关键技术手段开展研究。生咖啡豆酚类物质经80%甲醇、19%蒸馏水和1%乙酸（v/v）混合溶剂提取后，利用配备Prontosil 120–3-C18 ACE-EPS分析柱的Shimadzu高效液相色谱（HPLC）系统，结合紫外-可见光谱（200–700 nm）和质谱检测（正负离子模式，m/z 200–1200 Da）进行酚类化合物的鉴定与定量。苹果汁通过鲜果压榨制备。肽修饰实验采用两种条件：碱性条件（pH 9）和酶促条件（添加3 mL新鲜苹果汁，PPO活性6262.4 U/L，约引入18.8 U PPO），反应在25°C下持续搅拌并暴露于空气中24小时。产物经透析、冻干后，采用HPLC定量游离CQA衍生物的变化，MALDI-TOF-MS分析肽的分子质量变化，RP-HPLC（325 nm检测）结合8 M尿素处理以破坏非共价相互作用后测定与肽结合的CQA含量。所有定量分析均进行三次重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后多重比较检验进行统计分析（p ≤ 0.05）。研究样本来源包括：德国柏林Rohkaffee-Company提供的乌干达生咖啡豆，德国本地市场购买的五个苹果品种（Jonagold、Boskoop、Golden Delicious、Cox Orange和Braeburn），以及美国Davisco Foods Company提供的BZ1和GMP肽。
三、研究结果
3.1 咖啡中酚类化合物的HPLC-MS鉴定与谱分析
HPLC–MS分析显示，生咖啡豆在325 nm波长下的色谱图呈现8个主要峰，对应绿原酸衍生物。峰1–3鉴定为咖啡酰奎宁酸（CQA）异构体，即3-CQA、4-CQA和5-CQA，均具有m/z 353的[M–H]?离子及280/325 nm的特征紫外吸收。其中5-CQA是主要酚类成分，峰强度最高。峰4和5归属为阿魏酰奎宁酸（FQA）异构体，m/z 367。峰6–8归属为二咖啡酰奎宁酸（di-CQA），包括3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA，m/z 515，吸收峰位于325 nm。该分布与既往咖啡属物种研究数据一致，证实绿原酸类是生咖啡中的主要酚类类别。
3.2 Braeburn苹果品种酚类化合物的HPLC-MS鉴定
Braeburn苹果汁的HPLC色谱图在275和325 nm检测波长下显示多个峰。主要化合物包括5-O-咖啡酰奎宁酸（峰1，保留时间10.6 min，[M–H]? m/z 353）和4-O-对香豆酰奎宁酸（峰2，保留时间12.95 min，[M–H]? m/z 337）。峰3（保留时间25.0 min，m/z 567）归属为根皮素-2′-O-(2″-O-木糖基)葡萄糖苷；峰4（保留时间26.8 min，m/z 754）对应槲皮素糖苷，初步注释为槲皮素-鼠李糖-己糖-鼠李糖；峰5（保留时间28.5 min，m/z 975）为未鉴定化合物；峰6（保留时间12.05 min，m/z 289）为(+)-儿茶素/表儿茶素。除儿茶素仅在275 nm有吸收外，其余化合物均在275和325 nm显示吸收。
3.3 不同苹果汁的表征
研究人员对五个新鲜苹果品种（Jonagold、Boskoop、Golden Delicious、Cox Orange和Braeburn）的PPO活性和CQA含量进行了分析，以PPO活性最高作为选择合适天然生物催化剂的首要标准。
3.4 绿原酸（CQA）含量
五个苹果品种的CQA含量存在显著差异。Boskoop品种CQA含量最高（325.3 ± 5.3 μg/mL汁），Jonagold次之（141.5 ± 4.6 μg/mL），Cox Orange最低（63.6 ± 3.2 μg/mL）。这些差异可能与品种基因型、生产环境、采后处理、采收成熟度和储存条件等因素相关。
3.5 多酚氧化酶（PPO）活性
PPO活性通过4-甲基儿茶酚（4-MC）-脯氨酸加合物的吸光度-时间曲线线性区域斜率进行定量。Braeburn品种PPO活性最高，达6262.4 ± 462.6 U/L，显著超过其他品种。Jonagold和Golden Delicious呈中等活性（分别为3612.9 ± 186.1和3440.9 ± 315.4 U/L），二者无显著差异。Boskoop和Cox Orange的PPO活性显著较低，较Braeburn分别降低约94%和91%。Braeburn虽非CQA含量最低的品种，但因其PPO活性最高且CQA含量足以支持酶促氧化反应，被选为后续酶促肽修饰实验的PPO来源。
3.6 储存温度对PPO活性的影响
将新鲜Braeburn苹果在不同温度（25°C、4°C、?20°C和?80°C）储存1天后榨汁，随后将果汁在?20°C储存长达2周。在榨汁后即刻（第0周），由?20°C和?80°C储存苹果制备的果汁表现出极高的PPO活性（分别为15208.6和12163.4 U/L），而4°C和25°C储存者活性显著较低（5209.5和1780.7 U/L）。冷冻储存苹果后榨取的果汁PPO活性显著高于冷藏或室温储存，这可能归因于冷冻过程中冰晶形成破坏细胞膜，释放膜结合型PPO进入果汁基质。在?20°C储存1和2周后，所有样品的PPO活性仅出现轻微降低，表明冷冻条件下酶稳定性良好。
3.7 修饰过程中游离CQA衍生物的变化
在反应起始时（0 h），5-CQA是所有处理中的主要异构体（47.5–51.6 mg/g蛋白），显著高于其他CQA衍生物。3-CQA和4-CQA含量较低（7.3–10.8 mg/g蛋白），FQA1和di-CQA含量甚微（<5 mg/g蛋白）。24小时后，所有结合物的总CQA含量均显著降低：AGMP从69.0降至40.8 mg/g蛋白，ABZ1降幅最大（从67.8降至26.1 mg/g蛋白）。总di-CQA也显著降低，AGMP从10.0降至1.5 mg/g蛋白，ABZ1中几乎检测不到。碱性修饰导致的CQA衍生物减少程度大于酶促修饰，5-CQA在碱性条件下的降低更为显著，可能归因于5-CQA在碱性环境中异构化为3-和4-CQA。需注意，游离绿原酸衍生物的减少不应仅被解释为肽-酚共价结合的证据，绿原酸氧化为活性醌后可能发生多种竞争反应，包括肽结合、自聚合、缩合反应及结构重排或异构化。
3.8 CQA对肽结构性质的影响
MALDI-TOF质谱分析显示，未修饰BZ1肽在m/z 7089.2、7581.3、12463.5和14173.7处呈现特征性分子离子峰。修饰后，酶促和碱性处理样品在m/z约9300.1和18600处出现额外峰，表明BZ1经咖啡提取物处理后发生显著分子修饰。碱性环境促进了更异质性的修饰，可能涉及氧化或随机偶联反应。未修饰GMP在m/z 6802.6处呈现尖锐强峰。两种修饰条件下均出现m/z约9300和9500的新峰，与GMP-多酚复合物的形成一致。但MALDI-TOF-MS本身无法明确区分共价结合与其他可能的修饰过程（如交联或聚集）。
3.9 与修饰肽结合的CQA含量
采用8 M尿素处理以破坏非共价相互作用后，RP-HPLC分析显示游离CQA和CQA-肽加合物均在325 nm有吸收但保留时间不同，而对照肽在325 nm无显著吸收。ABZ1的CQA结合量最高（14.95 μg/mg蛋白），显著高于EBZ1。AGMP的CQA结合量（10.14 μg/mg蛋白）也明显高于EGMP。碱性条件下较高的结合量可归因于赖氨酸和半胱氨酸残基在碱性环境中亲核性增强，有利于与CQA来源醌类中间体形成更强的共价相互作用。但研究指出，MALDI-TOF-MS和RP-HPLC仅提供支持性证据，无法明确确定具体结合位点或加合物的化学结构。
四、讨论与结论
碱性处理虽导致绿原酸掺入程度高于PPO介导系统，但酶促途径具有多项潜在优势。碱性条件已知可促进绿原酸异构化、非特异性氧化反应及敏感氨基酸残基的可能修饰。相比之下，PPO介导的氧化在温和条件下进行，通过天然酶促机制生成活性醌，可能对氧化反应提供更好的控制并减少不良副反应。此外，苹果来源PPO代表食品级且天然存在的催化系统，可能比化学或高pH修饰方法更符合清洁标签加工策略。研究同时指出，碱性处理和PPO介导系统并非设计为等同反应环境：碱性处理作为促进酚-蛋白结合的常用参考方法，而酶促系统旨在模拟食品相关条件。从应用角度看，PPO介导系统可能比高碱性修饰系统更接近食品加工和制备过程中遇到的条件。
本研究证明，通过酶促（苹果汁来源多酚氧化酶）和碱性两种途径均可有效实现乳源生物活性肽与咖啡来源绿原酸的结合。生咖啡豆富含绿原酸衍生物，以5-CQA为主导，确认其作为酚类供体的适用性。Braeburn品种PPO活性最高且绿原酸含量适中，是受控结合的理想酶源。该酶在?20°C冷冻后保持强催化活性，确保实际应用的稳定性。定量分析显示碱性处理样品的CQA结合组分高于酶促处理。咖啡酚类提取物与苹果来源PPO的联合使用为肽-酚修饰提供了有前景的天然系统。研究结果为后续评估这些结合物的功能、生物、技术和感官特性奠定了基础，但还需进一步研究以评估其抗氧化活性、消化性、生物可及性、稳定性、安全性及食品应用的适宜性。
