原料食用昆虫 Tenebrio molitor、Acheta domesticus 与 Locusta migratoria 的微生物学评估：微生物负荷、可培养菌群及人兽共患病原菌基线

《JOURNAL OF FOOD QUALITY》：Microbiological Assessment of Raw Edible Insects Tenebrio molitor, Acheta domesticus and Locusta migratoria

　　

食用昆虫日益被视为可持续的替代蛋白来源；然而，其微生物学安全性仍是一个重要问题。本研究旨在评估欧洲联盟（European Union，EU）近期批准用于食品和饲料的三种昆虫物种——Tenebrio molitor、Acheta domesticus 和 Locusta migratoria——的微生物负荷与多样性。采用标准平板计数法进行微生物学分析，以评估嗜温需氧菌（mesophilic aerobic bacteria）总数、需氧和厌氧细菌芽孢（aerobic and anaerobic bacterial spores）数量、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、Escherichia coli（E. coli）、肠球菌（enterococci）、酵母和霉菌（yeasts and moulds）、凝固酶阳性葡萄球菌（coagulase-positive staphylococci）、Staphylococcus aureus（S. aureus）、推测 Bacillus cereus（B. cereus）、Clostridium perfringens（C. perfringens）以及 Salmonella spp. 的存在。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序鉴定了总共213株分离株。研究显示，所检测昆虫物种的所有微生物指标组具有可比的微生物负荷，并持续存在具有人兽共患潜力的细菌病原体，包括 Salmonella spp.、E. coli、C. perfringens、B. cereus group 和 S. aureus。Enterococcus spp. 是最常分离到的分类群，其次为广泛属，包括 Klebsiella、Lactococcus、Bacillus、Pediococcus、Enterobacter、Serratia、Kurthia、Staphylococcus、Morganella、Acinetobacter、Latilactobacillus、Tenebrionicola、Weissella、Citrobacter、Cutibacterium、Cytobacillus、Empedobacter、Leclercia 和 Proteus。尽管细菌组成在昆虫物种间存在差异，但 Enterobacteriaceae 和 Enterococcus spp. 在所有样品中占优势。这些发现为微生物学安全性评估提供了基线数据，并强调需要在养殖设施中进行定期微生物学监测、对饲料和垫料材料进行严格质量控制，以及采用适当的热处理和贮藏条件，以确保供人类消费的食用昆虫的安全性。

研究背景与问题：随着可持续发展与不断增长的世界人口，肉类消费持续增加，食物充足性需求突出。食用昆虫被视为传统肉类和鱼类产品的有吸引力的替代品；其营养谱因物种、性别、发育阶段、养殖条件和底物而异，但多数含有高水平蛋白质、必需氨基酸、脂质（主要不饱和脂肪酸）、纤维（甲壳素）、微量营养素（铁、铜、锌）和维生素（硫胺素、核黄素、钴胺素、烟酸），常与传统肉鱼产品相当或更高，且环境足迹较低。欧盟新型食品法规（Novel Food Regulation (EU) 2015/2283）下，根据多个 Commission Implementing Regulations (EU)，一些昆虫被授权为新型食品，包括 Acheta domesticus（家蟋蟀）、Tenebrio molitor larva（黄粉虫）、Locusta migratoria（飞蝗）和 Alphitobius diaperinus（小粉虫），并规定允许形态和食品类别。它们也被授权用于饲料。虽然益处明显，但消费昆虫存在过敏、化学或生物危害，尤其微生物安全。原料食用昆虫通常含高嗜温需氧菌、芽孢形成菌和细菌内生芽孢、肠杆菌科、乳酸菌、嗜冷需氧菌和真菌。可传播病原包括 Enterococcus、Campylobacter、Streptococcus、Staphylococcus、Pseudomonas、Bacillus、Clostridium，以及肠杆菌科中 Escherichia、Enterobacter、Salmonella、Klebsiella、Serratia、Shigella、Yersinia；最重要病原种包括 Bacillus cereus group、Escherichia coli、Clostridium perfringens、Salmonella enterica 和 Listeria monocytogenes。微生物负荷受原料微生物、加工中减少或增殖、后处理二次污染影响。尽管新型食品授权过程进行了安全评估，但微生物组成高度动态，受养殖环境、饲料和处理影响，连续基线数据仍必要。研究人员因此评估三种 EU 授权用于食品和饲料的昆虫原料的微生物负荷与病原菌。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员从 Czech University of Life Sciences Prague (CZU) 动物学与渔业系养殖设施获取 Tenebrio molitor、Acheta domesticus 和 Locusta migratoria。每种昆虫取三个批次三个子样本，冻干后 ?80°C 保存。采用标准平板计数和 ISO 方法评估多组微生物指标，并用 MALDI-TOF MS 和 16S rRNA 基因测序鉴定分离株。结果显示三种原料昆虫的食品安全和卫生指标微生物负荷可比，统计无显著差异（p≥0.05），所有样品均检出具有人兽共患潜力的病原菌，包括 Salmonella spp.、E. coli、C. perfringens、B. cereus group 和 S. aureus；Enterococcus spp. 最常分离，Enterobacteriaceae 和 Enterococcus spp. 在所有样品中占优势。该研究为食用昆虫微生物安全评估提供基线数据，突出养殖设施定期监测、饲料和垫料质量控制以及消费前适当热处理和贮藏的重要性。

主要关键技术方法（不超过250字）：样本来自 CZU 养殖设施，三种昆虫各三个批次三个子样本；收获前禁食24 h，?18°C冷冻杀死，冻干后 ?80°C保存。采用标准平板计数及 ISO 方法测定嗜温需氧菌、需氧和厌氧细菌芽孢、肠杆菌科、E. coli、肠球菌、酵母和霉菌、凝固酶阳性葡萄球菌、S. aureus、推测 B. cereus、C. perfringens 和 Salmonella spp.；分离株用 MALDI-TOF MS 鉴定，未能可靠鉴定的用 16S rRNA 基因测序；计数数据用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和 Scheffe 两两比较，显著性水平 p=0.05。样本队列来源：捷克生命科学大学 CZU 动物学与渔业系养殖设施。

研究结果：
3.1 细菌计数：通过标准平板计数，所有测试物种细菌负荷非常相似，统计无显著差异。L. migratoria 的 S. aureus 和厌氧细菌芽孢总数最高，但差异不显著。所有物种 Salmonella spp. 阳性，C. perfringens 和 S. aureus 阳性；E. coli 计数 <1 log CFU/g 但检出；除 S. aureus 外无凝固酶阳性葡萄球菌。关键计数（log CFU/g）包括：嗜温需氧菌 T. molitor 7.2±0.5、A. domesticus 7.3±0.2、L. migratoria 7.7±0.9；厌氧菌 8.0±0.1、7.5±0.1、7.4±1.0；肠球菌 5.7±0.1、6.3±0.4、6.2±1.4；肠杆菌科 5.0±0.4、4.9±0.2、4.3±0.9；酵母和霉菌 3.0±1.0、3.5±0.2、3.9±1.2；推测 B. cereus 2.3±1.2、1.4±0.7、1.7±1.2；C. perfringens 1.6±1.2、<1.0、1.7±1.2；S. aureus 2.0±0.0、2.0±0.0、3.4±1.3。
3.2 细菌鉴定：研究人员选择212株纯菌株进一步鉴定（132株来自非选择性培养基，80株来自选择性培养基）。MALDI-TOF MS 成功鉴定196株，其中141株达到可能种水平（score≥2.000），55株为可能属水平（1.700–1.999），16株不可靠（score<1.700）。剩余16株用 16S rRNA 基因测序，均来自 A. domesticus（3株）和 T. molitor（13株），鉴定出 Enterococcus faecalis、Lactococcus taiwanensis、Tenebrionicola larvae、Enterococcus larvae、Staphylococcus epidermidis 等。所有昆虫物种中最常见为 Enterococcus；Bacillus、Enterobacter、Klebsiella、Lactococcus 在所有物种出现；Kurthia、Morganella、Pediococcus、Staphylococcus 从 A. domesticus 和 L. migratoria 分离；Acinetobacter、Citrobacter、Salmonella 仅从 T. molitor 分离；Cutibacterium 仅从蟋蟀分离；Empedobacter、Serratia、Weissella 从草蜢样品分离。尽管细菌组成因物种而异，Enterobacteriaceae 和 Enterococcus spp. 在所有样品中占优势。

讨论部分总结：讨论强调 EU Novel Food Regulation 的微生物限值并非对所有食用昆虫一概适用，而是与具体新型食品批准相关。授权产品（如 T. molitor、A. domesticus、L. migratoria 的冷冻、干燥或粉末形式）不得超过：嗜温需氧菌 10⁵ CFU/g、酵母和霉菌 100 CFU/g、E. coli 50 CFU/g、推测 B. cereus 100 CFU/g、推测 Enterobacteriaceae 100 CFU/g、凝固酶阳性葡萄球菌 100 CFU/g，Salmonella spp. 和 L. monocytogenes 25 g 不得检出，S. aureus 不得存在；这些限值适用于经禁食24 h和热处理后的特定产品，不能推广至所有原料食用昆虫。原料昆虫嗜温需氧菌 7.2–7.7 log CFU/g 达到或略超 7 log CFU/g 的一般食品腐败阈值，提示易快速微生物降解；结果与 Veveris et al.、Klunder et al.、?kvorová et al.、Stoops et al. 等研究可比。厌氧菌 7.4–7.8 log CFU/g，与其他食用昆虫研究一致。肠球菌无特定限值，但高数量可能腐败并出现致病/潜在致病种如 Enterococcus faecalis，部分可耐热并传播抗生素耐药基因，部分菌株益生。肠杆菌科 4.3–5.0 log CFU/g，低于其他研究报告的 6–8 log CFU/g，受禁食、养殖条件和物种影响，且热敏感。E. coli 和 Salmonella 在所有样品检出，与多数研究不同；Wynants et al. 认为 Salmonella 不殖民黄粉虫消化道，检出取决于饲料/基质污染；与 ?kvorová et al. 在同一设施先前阴性结果相比，提示可能基质或饲料污染，强调养殖环境监测。S. aureus 2.0–3.4 log CFU/g，低于产毒临界 5 log CFU/g，但耐热毒素需贮藏控制。芽孢可存活加工，B. cereus group 与胃肠和肠外感染相关，T. molitor 略超立法限值但低于产毒阈值 4–5 log CFU/g；C. perfringens <1–1.7 log CFU/g，低于 5 log CFU/g 临界，孢子耐热，建议热处理、漂烫、干燥或两阶段巴氏。酵母和霉菌低于 5–6 log CFU/g 的可见腐败/霉菌毒素风险阈值。细菌群落以 Bacillota 和 Pseudomonadota 为主，Bacillota 主要为 Bacillales 和 Lactobacillales，Pseudomonadota 主要为 Enterobacterales。作者指出不能仅凭未加工原料微生物组成评估昆虫消费适宜性；加工和贮藏显著影响病原；分析前冷冻可能影响微生物群并可能降低计数；适当热处理可降低污染达六个数量级；Galli et al. 未检出病原可能因热处理，而本研究反映未加工原料基线。

研究结论翻译：本研究显示原料食用昆虫 Tenebrio molitor、Acheta domesticus 和 Locusta migratoria 在食品安全和卫生标准方面具有可比的微生物负荷。所有样品均对具有人兽共患潜力的细菌病原体呈阳性，如 Salmonella spp.、Bacillus cereus group 细菌和 Clostridium perfringens 或 Staphylococcus aureus；Escherichia coli 也存在但水平低（<1.0 log CFU/g）。尽管最丰富的可培养细菌部分组成在昆虫物种间不同，但肠球菌和肠杆菌科成员在所有样品中为优势组。总体而言，本研究结果促使食用和饲料昆虫生产者实施养殖设施定期监测，并建议对饲料和垫料材料进行质量控制。结果还强调消费前需进行适当热处理和充分贮藏条件以确保微生物安全性。