噪声诱导性听力损失（NIHL）小鼠耳蜗蛋白质组景观：80个NIHL相关蛋白签名及五类功能模块解析

《Cell Biology International》：Proteomic Signatures of Noise-Induced Hearing Loss in the Mouse Cochlea

听力损失（hearing loss, HL）影响全球超过15亿人，并造成显著的社会、教育和经济负担。尽管遗传学研究已鉴定出众多听力损失相关基因，但伴随噪声诱导性听力损失（noise-induced hearing loss, NIHL）的分子变化仍未被完全理解。研究人员使用纳米液相色谱-串联质谱（nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry, nano-LC–MS/MS）和整合生物信息学工作流程，表征了损伤性噪声暴露后成年小鼠耳蜗蛋白质组。对正常听力（normal hearing, NH）和NIHL耳蜗的比较谱分析鉴定出1742个蛋白质以及一个80蛋白的NIHL相关签名，包括49个定量定义的差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）和31个条件特异性蛋白质。这些蛋白质被组织为五个功能组，涵盖代谢和线粒体功能、蛋白质合成和核糖核蛋白复合物、结构和突触组织、细胞极性和细胞骨架重塑，以及调控和应激响应功能。代表性改变包括HSPA9降低，HSPA9是一种参与蛋白质稳态的线粒体伴侣；RNA相关蛋白PRMT1和CIRBP发生变化；与细胞外基质组织相关的HAPLN1降低；与细胞极性相关的信号蛋白MAP2K2发生改变；以及SYNJ2增加。与一个独立的耳蜗蛋白质组数据集的比较发现，80个蛋白质中有39个失调，其中22个显示一致的方向性变化。单细胞转录组映射（single-cell transcriptomic mapping）为80个蛋白质相关基因中的74个提供了细胞背景，而人类遗传和疾病注释支持优先考虑与听力或耳表型相关的选定蛋白质。总之，这些发现定义了噪声暴露耳蜗的蛋白质组景观，并鉴定了用于进一步研究NIHL的分子候选物和细胞过程。

研究背景与问题。听力损失（hearing loss, HL）影响全球超过15亿人，造成社会、教育、职业和经济负担。遗传因素约占HL病例的50%–60%，其中近70%为非综合征型；已定位200多个基因组位点，但致病基因仅约170个，说明关键基因产物和分子通路仍未明。环境因素包括噪声、感染、耳毒性药物，以及糖尿病和年龄相关退化。噪声诱导性听力损失（noise-induced hearing loss, NIHL）是第二常见环境诱导HL，全球约11亿人面临风险。耳蜗是听觉信号转导核心，易受结构和功能损伤；转录组不能一致反映蛋白丰度，而质谱（mass spectrometry, MS）蛋白质组可直接研究蛋白网络。但NIHL耳蜗蛋白质组因耳蜗小、细胞异质和材料有限而未充分表征。因此研究人员开展本研究，旨在用高分辨率MS和整合生物信息学表征NH和NIHL成年小鼠耳蜗蛋白质组，识别蛋白签名和生物过程，为NIHL分子过程研究提供基础。研究人员比较正常听力（normal hearing, NH）和NIHL耳蜗，鉴定1742个蛋白和80蛋白NIHL签名，包括49个定量差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）和31个条件特异性蛋白，组织为五功能组。与独立数据集比较，39/80失调，22一致；单细胞转录组映射为74/80基因提供细胞背景；人类遗传和疾病注释支持选定蛋白优先。意义在于定义噪声暴露耳蜗蛋白质组景观，提供分子候选和细胞过程。

关键技术方法（约230字）。样本来源为巴西圣保罗大学医学院Bioterium Center的雄性BALB/c小鼠（Mus musculus），P30，共12只，6只NH、6只NIHL；NIHL由130 dB SPL宽带白噪声暴露48 h诱导；用听觉脑干反应（auditory brainstem responses, ABR）确认听力。耳蜗解剖后，按条件合并为三个生物学重复，每个重复含两只动物的四耳蜗。主要技术包括nano-LC–MS/MS、MaxQuant和Perseus进行标签无标记定量（label-free quantification, LFQ）和差异分析；基因本体论（Gene Ontology, GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）过表征分析、STRING蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络；与Jongkamonwiwat et al. (2020)外部耳蜗蛋白质组数据比较；与Jean et al. (2023) P20小鼠耳蜗单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）图谱映射；人类表型本体（Human Phenotype Ontology, HPO）/哺乳动物表型本体（Mammalian Phenotype Ontology, MPO）/在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）/ORPHANET/MONDO疾病本体（Mondo Disease Ontology, MONDO）/耳聋位点（deafness loci, DFN）定位和Pharos可成药性分类。

研究结果。3.1 正常和噪声暴露小鼠的全面耳蜗蛋白质组景观：通过nano-LC–MS/MS共鉴定1742个蛋白，NH 1572、NIHL 1605，共享1435，NH独有137，NIHL独有170。PANTHER分类显示代谢互转酶19.1%、细胞骨架蛋白8.7%、蛋白修饰酶8.6%等；25个蛋白对应人类耳聋相关基因直系同源物。结论是建立耳蜗蛋白质组基线并支持生物学相关性。3.2 NH和NIHL耳蜗蛋白质组的功能相似性与差异功能特征：加权集覆盖GO富集显示共享能量代谢、超分子纤维/细胞骨架组织、有机氮化合物生物合成/分解和蛋白复合物组装；NH保留蛋白成熟和响应内源性刺激，NIHL保留RNA剪接和细胞骨架组织。1635个基因映射到P20单细胞图谱七大类，胶质、支持、神经元最高。结论是整体功能相似但相对代表性不同。3.3 NIHL耳蜗中DAPs的鉴定：1245个蛋白用于差异分析，50个满足p≤0.05、|log₂FC|≥0.2、|t|≥2.5；排除两个血红蛋白和合并Serpina1亚型后49个DAPs，23上调、26下调。条件特异31个（21 NIHL独有，10 NH独有），合并80蛋白。最大差异包括HAPLN1、SIRT2、ANXA5、ANXA6、CYB5A、LRRC59降低，TPM3、SARNP、EIF4E、SERPINA1C、RPL27升高等。结论是定义NIHL相关蛋白集。3.4 跨研究比较揭示共享噪声响应耳蜗蛋白质组签名：与Jongkamonwiwat et al. (2020)独立数据集比较，39/80（48.8%）在94或105 dB SPL噪声后失调，22个方向一致（12上调，10下调）。一致下调包括ANXA6、CYB5A、HAPLN1、MAP2、VAMP3等，一致上调包括NUDCD3、PRRC1、SNW1等。结论是存在可重复核心。3.5 NIHL相关蛋白在耳蜗细胞类型中的转录景观：80蛋白中74个对应转录本在P20 scRNA-seq图谱七大类检测到，6个未检测。多数广泛表达；Gpx2在root cells top 0.4%，Ehd3在血管纹，Ighm在B细胞，Map2和Prph在螺旋神经节神经元等。结论是提供基础细胞框架，不建立蛋白细胞来源。3.6 功能富集突出与NIHL相关的代谢、生物合成和蛋白处理过程：GO生物学过程硫化合物代谢、酰胺代谢、翻译、酰胺/肽生物合成；细胞组分线粒体、三羧酸循环（tricarboxylic acid, TCA）酶复合体、核糖核蛋白复合体、突触区域、极化生长位点；KEGG半胱氨酸和蛋氨酸代谢最显著。结论是NIHL签名涉及代谢、生物合成和蛋白处理。3.7 计算机优先级整合遗传、表型和药理证据：15个蛋白对应人类直系同源可定位到未解决DFN位点；16个与听力功能或耳形态相关；14个与综合征相关；18个优先蛋白列为CAT、CTSD、FH、GALNS、GPX4、HAPLN1、HCFC1、HSPA9、IGF2、IGHM、MAP2K2、MYO1C、PHGDH、PSAP、RPS23、SRP19、SYNJ2、TPM3。根据Pharos的IDG框架，MAP2K2和TUBB6为Tclin（临床验证靶点），13个为Tchem（具有已知高亲和力小分子配体靶点），其余为Tbio（生物学表征靶点）或Tdark（表征不足靶点）。结论是提供遗传、表型和药理背景。3.8 噪声响应耳蜗蛋白的整合功能分类：整合GO/KEGG、STRING PPI、UniProt和单细胞图谱，将80个DAPs分为五组：G1代谢和线粒体功能（20）；G2蛋白合成和核糖核蛋白复合物（17）；G3结构和突触组织（15）；G4细胞极性和细胞骨架重塑（6）；G5调控、应激响应和专门功能（25）。MAP2、PPP1R2、SIRT2双归G3/G4。PPI揭示组内和跨组连接。结论是形成五类功能模块。

讨论部分总结。讨论指出全耳蜗匀浆蛋白质组提供成熟耳蜗整合视图，但混合样本限制细胞类型分辨。NH与NIHL共享核心过程，但RNA剪接和细胞骨架组织等相对代表性变化。NIHL签名中39/80与独立数据集重叠，方向一致反映可重复核心，不一致反映暴露强度和实验背景差异。G1代谢和线粒体：HSPA9降低，FH、OGDH、PDHB、HMGCS2降低，GPX4降低而CAT升高，AHCY、MAT2B、PHGDH等变化。G2翻译和RNA处理：核糖体蛋白和翻译起始因子上调，剪接体成分下调，EIF4E、CIRBP、PRMT1、SNW1等。G3结构和突触：HAPLN1、MAP2、VAMP3、MYO1C、EHD3降低，SYNJ2、TPM3、TUBB6、PRPH等升高。G4极性和细胞骨架：MAP2K2、PPP1R2升高，BASP1、DBNL、MAP2、SIRT2降低。G5调控、应激、免疫、溶酶体：A2M、SERPINA、CTSD、PSAP、IGF2等变化。局限性包括全耳蜗匀浆和混合样本、未进行免疫印迹/免疫组化/靶向蛋白质组/功能验证、人与小鼠位点对应只用于候选优先、网络为预测。未来需细胞类型分辨或空间蛋白质组学、靶向验证、纵向和功能研究。

研究结论翻译。本研究对噪声暴露后成年小鼠耳蜗进行了系统级蛋白质组学表征，鉴定了一个NIHL相关签名，包括49个定量定义的DAPs和31个条件特异性蛋白。这些蛋白被组织为五个功能组，涵盖代谢和氧化还原过程、RNA相关调控、结构和突触组织、极性和细胞骨架信号，以及专门调控、免疫相关、溶酶体和膜相关功能。总之，这些发现表明声损伤伴随耳蜗多个分子过程的协调变化。与功能富集、PPI分析、独立耳蜗蛋白质组数据集、耳蜗单细胞转录组背景和人类遗传注释的整合，为蛋白质组签名的生物学解释提供了补充支持，并使选定蛋白得以优先用于进一步研究。跨研究比较进一步突出了可重复和情境依赖的蛋白响应，而转录组和遗传信息为签名中选定组分提供了额外细胞和生物学背景。未来结合细胞类型分辨或空间蛋白质组学、靶向蛋白验证、纵向分析和功能方法的研究，将对于定义所鉴定分子变化的细胞特异性、时间行为和机制意义很重要。这类研究可能有助于确定这些改变如何促进声损伤后耳蜗易感性和恢复，并推动当前蛋白质组框架走向对NIHL更机制性的理解。