《Chemical Biology & Drug Design》：An Anoikis-Related Gene Signature Associated With Stromal Remodeling and Clinical Outcome in Gastric Cancer
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摘要：胃癌（gastric cancer, GC）仍然是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，预后较差。失巢凋亡（anoikis）抵抗与肿瘤进展和转移密切相关，但失巢凋亡相关基因（anoikis-related genes, ARGs）在胃癌中的预后和功能相关性仍不完全清
摘要：胃癌（gastric cancer, GC）仍然是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，预后较差。失巢凋亡（anoikis）抵抗与肿瘤进展和转移密切相关，但失巢凋亡相关基因（anoikis-related genes, ARGs）在胃癌中的预后和功能相关性仍不完全清楚。研究人员整合了公共转录组学、临床、体细胞突变和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集，以识别差异表达的ARGs，开发基于ARG的风险模型，并探讨其与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）特征的相关性。通过体外实验评估选定候选基因对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。在癌症基因组图谱胃腺癌（The Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma, TCGA-STAD）队列中鉴定出45个差异表达的ARGs。利用TCGA-STAD队列开发了基于ARG的风险模型，并在GSE84437队列中进行评估。该模型与总生存期相关，并为风险分层提供了潜在价值，但其区分性能中等。高风险患者表现出独特的免疫、间质和体细胞突变特征。单细胞分析表明，ARG相关的转录程序与胃癌微环境中的间质重塑和内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT）相关特征有关。在核心ARGs中，EEF1A2和TAGLN显示出预后相关性，并且在胃癌组织中蛋白表达水平更高。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的任一基因敲低均降低了HGC-27细胞的迁移和侵袭能力。这些发现表明，ARG相关的分子特征与胃癌预后及免疫-间质特征相关，而EEF1A2和TAGLN可能是与胃癌细胞迁移和侵袭相关的候选基因。
论文解读：基于失巢凋亡相关基因特征的胃癌间质重塑与临床预后研究
1. 研究背景与研究目的
胃癌（gastric cancer, GC）是全球高发的恶性肿瘤之一，尽管手术、化疗、放疗、免疫治疗及靶向治疗取得了进展，但晚期患者的复发和转移仍是重大挑战。失巢凋亡（anoikis）是一种由细胞外基质附着丢失或细胞-细胞粘附中断引发的程序性细胞死亡形式。肿瘤细胞获得失巢凋亡抵抗能力后，能在脱离基质后存活，从而促进迁移、侵袭及远处转移，这与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的重塑密切相关，尤其是间质和内皮成分的改变。其中，内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT）使内皮细胞获得间充质样特征，参与肿瘤内间质重塑。然而，失巢凋亡相关基因（anoikis-related genes, ARGs）在胃癌中的转录程序与EndMT相关细胞状态之间的关联尚不明确。因此，本研究旨在整合多组学数据，构建并验证基于ARG的风险模型，探索其与胃癌预后、免疫浸润、间质特征及体细胞突变景观的关系，并通过单细胞分析和体外实验揭示其在肿瘤进展中的潜在机制。
2. 主要研究方法
研究人员从UCSC Xena平台获取癌症基因组图谱胃腺癌（TCGA-STAD）队列（412例肿瘤样本，36例正常组织）的转录组和临床数据，从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取GSE84437队列（433例胃癌样本）用于外部验证，并从GeneCards数据库检索得到913个候选ARGs。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自GSE162115数据集，用于分析细胞异质性和EndMT特征。研究人员采用十种机器学习算法（包括弹性网络、岭回归、偏最小二乘回归Cox模型、逐步Cox回归、LASSO、生存支持向量机、随机生存森林、监督主成分、CoxBoost和广义提升回归模型）组合成101种算法，通过十倍交叉验证在TCGA-STAD队列中训练模型，并以一致性指数（concordance index, C-index）评估性能，最终选取StepCox[forward] + Survival-SVM模型进行后续分析。此外，通过ESTIMATE算法计算间质和免疫评分，利用CIBERSORT估算免疫细胞比例，并使用inferCNV评估转录异质性，Monocle 3进行伪时间轨迹分析。
3. 研究结果
3.1 差异表达ARGs的筛选与功能富集分析
在TCGA-STAD队列中，通过比较胃癌与正常组织，鉴定出45个差异表达的ARGs。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示这些基因涉及凋亡、肌动蛋白细胞骨架调控、胰岛素抵抗等通路；基因本体论（Gene Ontology, GO）分析则富集于凋亡过程、囊泡与细胞外基质组分、内肽酶活性及Toll样受体结合等生物学过程，表明差异表达ARGs参与胃癌进展相关过程。
3.2 ARG风险模型的构建与外部验证
基于45个差异表达ARGs，研究人员在TCGA-STAD队列中构建模型并在GSE84437队列中验证。StepCox[forward] + Survival-SVM模型在两个队列中C-index分别为0.580和0.578，表现一致。模型包含21个核心ARGs（如PDK4、NGFR、CMA1、EEF1A2、TAGLN等）。按中位风险评分将患者分为高低风险组，Kaplan-Meier分析显示高风险组总生存期显著更差（TCGA-STAD：HR=1.56, p=0.005；GSE84437：HR=1.73, p<0.001）。多变量Cox回归证实风险评分是独立预后因素（HR=2.187, p=0.007）。
3.3 ARG风险模型相关的免疫与基因组特征
ESTIMATE分析显示高低风险组在ESTIMATE评分、免疫评分和间质评分上存在显著差异，表明TME特征不同。全外显子测序（whole-exome sequencing, WES）分析揭示两组体细胞突变景观存在差异。免疫相关基因（如AHSA1、CD163、CD37、IL2RB）和细胞因子相关基因（如IL10、IL13、IL15、IL16）在两组间差异表达。CIBERSORT分析显示多种免疫细胞亚群（如初始B细胞、活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助T细胞、静息NK细胞、单核细胞、M2巨噬细胞、活化树突状细胞、肥大细胞和中性粒细胞）比例存在差异。此外，ARG风险评分与CD86表达呈正相关（r=0.33, p<0.001）。
3.4 单细胞分析揭示ARG转录程序与间质重塑及EndMT特征的关联
通过对GSE162115 scRNA-seq数据分析，研究人员注释出七种主要细胞类型（T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、内皮细胞、成纤维细胞和单核/巨噬细胞）。inferCNV分析显示内皮细胞和成纤维细胞表现出更高的转录异质性。成纤维细胞被细分为10个亚群（F0-F9），其中F2、F3、F4、F8、F9的inferCNV评分较高。伪时间轨迹分析显示内皮细胞分布于早期状态，多个成纤维细胞亚群位于后期状态，提示两者之间存在转录状态转变关系。核心ARGs呈现细胞类型特异性表达模式。ARG评分与EndMT评分呈正相关，动态表达分析显示CD36沿间质状态轨迹逐渐降低，而CRYAB和SFRP1升高。
3.5 EEF1A2和TAGLN的功能验证
Kaplan-Meier分析显示ADAMTS1、AR、CD36、EEF1A2、MAPK10、SNCG、TAGLN、NGFR和NTRK3与总生存期相关。人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据显示ADAMTSL1、EEF1A2、SNCG和TAGLN在胃癌组织中蛋白表达高于正常组织。选择EEF1A2和TAGLN进行功能验证，siRNA敲低后，Transwell实验显示HGC-27细胞迁移和侵袭能力显著下降。
4. 讨论与结论
研究人员指出，失巢凋亡抵抗是肿瘤转移的关键环节，本研究开发的ARG风险模型虽区分性能中等，但与预后、免疫浸润、间质特征及体细胞突变相关。单细胞分析提示ARG转录程序可能与EndMT相关的间质重塑有关。EEF1A2和TAGLN的敲低抑制了胃癌细胞迁移和侵袭，支持其促癌作用，但未直接证明其参与失巢凋亡抵抗或EndMT。研究局限性包括：初始ARG集合基于宽泛检索可能引入噪声；模型需更大规模多中心验证；功能实验仅在单一细胞系进行，缺乏失巢凋亡抵抗的直接证据；inferCNV和伪时间分析仅反映转录异质性和潜在状态关系，非确切的基因组改变或EndMT事件。
研究结论：本研究构建了一个经外部验证的基于ARG的风险模型，该模型与胃癌预后、TME特征及体细胞突变景观相关。单细胞和体外分析进一步表明，ARG相关转录程序可能与EndMT相关的间质重塑及胃癌细胞迁移和侵袭有关。这些发现支持了ARG相关分子特征在胃癌中的临床和生物学意义。
