整合单细胞转录组学与计算药理学解析冠状动脉粥样硬化中巨噬细胞异质性及推定THBS1-CD36轴

《Chemical Biology & Drug Design》：Integrative Single-Cell Transcriptomics, Multi-Omics Analyses, and Computational Pharmacology Reveal Macrophage Heterogeneity and the Putative THBS1-CD36 Axis in Coronary Atherosclerosis

冠状动脉粥样硬化（coronary atherosclerosis, CA）以显著的巨噬细胞异质性为特征，该异质性驱动斑块进展与易损性，但精确的亚群及其小生境特异性功能仍未完全明确。在此，研究人员利用数据集GSE131778构建了人CA的单细胞转录组图谱，并鉴定出六个不同的巨噬细胞亚群。其中，THBS1⁺巨噬细胞亚群表现为终末分化、缺氧适应的人群，具有升高的转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信号和FOSB驱动的转录调控。高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA）揭示了12个转录模块，其中模块NEW10作为THBS1⁺巨噬细胞的特异性分子特征。细胞—细胞通讯分析预测了THBS1-CD36配体—受体相互作用，可能促进THBS1⁺巨噬细胞与淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）之间的串扰。分子对接和100-ns分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟预测SMS121与CD36之间存在热力学有利且构象稳定的相互作用，为进一步实验评估提供了初步计算依据。最后，利用NEW10模块基因，研究人员训练了13个机器学习分类器以区分急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome, ACS）与稳定型冠状动脉疾病（stable coronary artery disease, sCAD），并评估其在区分破裂斑块与稳定斑块中的性能；线性核支持向量机（Support Vector Machine with linear kernel, SVM-Linear）和朴素贝叶斯（Naive Bayes）在独立测试队列中达到最高准确度，二者受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC）均为0.9333。这些发现阐明了CA中的巨噬细胞异质性和细胞间通讯，将预测的THBS1-CD36相互作用确定为进一步机制和药理学研究的候选对象，并建立了一种巨噬细胞来源的转录特征用于精确风险分层。

冠状动脉粥样硬化（coronary atherosclerosis, CA）是全球发病和死亡的主要原因，急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome, ACS）常由易损动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀引起。稳定斑块向不稳定斑块的病理转变涉及脂质蓄积、慢性炎症和动脉壁异常重构。巨噬细胞是动脉粥样硬化病变中最主要的免疫细胞，参与脂质吞噬、泡沫细胞形成、促炎细胞因子和基质降解酶分泌。传统bulk转录组方法掩盖细胞异质性，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）虽已揭示斑块巨噬细胞异质性，但人CA中巨噬细胞亚群的精确分类、发育轨迹、基因调控网络、小生境特异性通讯及其临床转化潜力仍未完全阐明。因此，研究人员利用数据集GSE131778构建人CA单细胞转录组图谱，鉴定六个巨噬细胞亚群，聚焦THBS1⁺亚群，并整合hdWGCNA、拟时序、pySCENIC、CellChat、分子对接、分子动力学和机器学习，探索其表型、调控、通讯、候选药理干预及风险分层价值。研究结论表明THBS1⁺巨噬细胞呈终末分化、缺氧适应、TGF-β富集和FOSB相关调控，预测THBS1-CD36轴和SMS121-CD36相互作用，并建立NEW10特征用于区分冠脉不稳定性的临床和形态学表现，为机制、药理学和转化研究提供框架。

关键技术方法概述：研究人员使用公共单细胞数据集GSE131778（8例人冠状动脉斑块组织）构建图谱，Seurat进行质控、标准化和主成分分析（principal component analysis, PCA），Harmony去除批次效应，均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）降维聚类，共保留11,756个高质量细胞。提取1093个巨噬细胞后二次聚类为六个亚群；进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集、hdWGCNA、Monocle 2拟时序、pySCENIC调控子推断和CellChat细胞通讯。对CD36和THBS1结构进行分子对接、100-ns分子动力学模拟和自由能景观分析。机器学习使用GSE236610训练队列（14例ACS、13例sCAD）和GSE41571独立测试队列（5例破裂斑块、6例稳定斑块），训练13种二分类器，以NEW10模块基因为特征，评估AUC、敏感性和特异性。

研究结果：
3.1 人冠状动脉粥样硬化的单细胞转录组景观：研究人员分析GSE131778的11,756个高质量细胞，经无监督聚类和UMAP可视化识别18个细胞群，包括T细胞、NK细胞、B细胞、浆细胞、单核细胞、循环髓系细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞、Schwann细胞、淋巴内皮细胞、动脉内皮细胞和静脉内皮细胞；密度图、Sankey图、标志基因热图和特征图验证注释。结论为提供CA微环境的单细胞概览和后续异质性分析基础。

3.2 异质性巨噬细胞亚群在CA中呈现不同转录身份：提取1093个巨噬细胞再聚类，鉴定CYP1B1⁺（n=207）、MX1⁺（n=96）、PDLIM1⁺（n=75）、PLD4⁺（n=284）、SPP1⁺（n=206）和THBS1⁺（n=225）六个亚群；PLD4⁺占比最大26.0%，THBS1⁺为20.6%。点图显示亚群特异标志基因低重叠；GO生物学过程、细胞组分和分子功能富集显示抗原加工呈递、炎症反应、脂质代谢、内体/溶酶体/细胞外基质和细胞因子结合等差异。结论为巨噬细胞在CA斑块中具有功能异质性。

3.3 hdWGCNA揭示巨噬细胞多样性的模块转录程序：软阈值功率为8，R²=0.8044，平均连通性67.96；鉴定12个模块NEW1-NEW12，各模块有前10个hub基因；模块活性UMAP显示亚群偏好，模块相关矩阵显示正负关联，点图突出特定亚群富集模块，网络展示hub基因共表达。NEW10被用于后续THBS1⁺特征。

3.4 拟时序轨迹和转录因子调控子动态：Monocle 2重建分支轨迹，状态分配支持不同分化命运；沿拟时序差异基因和GO生物学过程富集涉及免疫激活、脂质处理和凋亡；代表性标志基因曲线动态变化。THBS1⁺巨噬细胞缺氧评分最高，TGF-β信号最强。pySCENIC显示各亚群调控子激活模式不同，FOSB在THBS1⁺中表达和调控子活性最高。结论为THBS1⁺处于终末位置，呈缺氧反应状态并伴FOSB调控子活性升高。

3.5 细胞—细胞通讯分析识别THBS1⁺巨噬细胞介导的信号重塑：CellChat显示各巨噬细胞亚群与内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和淋巴细胞等有不同配体—受体连接；THBS1⁺与多个细胞区室广泛互作。通路分析显示THBS1⁺中MIF信号预测降低，THBS信号增强，THBS1⁺为THBS通路主要发送者。配体—受体分析预测THBS1⁺巨噬细胞与LEC之间存在THBS1-CD36相互作用，其他巨噬细胞亚群未检测到。结论为THBS1⁺具有独特预测通讯谱，但功能后果需实验验证。

3.6 分子对接和分子动力学模拟显示SMS121与CD36高亲和结合：基于THBS1-CD36轴，研究人员模拟THBS1⁺通过THBS1结合CD36向LEC信号。蛋白—蛋白对接显示复合物空间构象，SMS121占据CD36配体结合口袋，结合亲和力?7.24 kcal/mol，2D相互作用图显示氢键、范德华力和疏水作用。100-ns MD中均方根偏差（root-mean-square deviation, RMSD）、回转半径（radius of gyration, Rg）、氢键数和溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area, SASA）趋于稳定平衡，Gibbs自由能景观显示低能结合盆地。结论为SMS121-CD36相互作用在计算上具有热力学有利和构象稳定，需实验评估。

3.7 机器学习评估THBS1⁺巨噬细胞基因特征：利用NEW10模块基因训练13种二分类器，GSE236610训练（14 ACS、13 sCAD），GSE41571测试（5破裂、6稳定）。SVM-Linear和Naive Bayes在破裂与稳定斑块区分中AUC最高，均为0.9333；神经网络AUC=0.8667；K近邻（K-Nearest Neighbors, KNN）0.4333，径向基核支持向量机（SVM with radial basis function kernel, SVM-RBF）、线性判别分析（Linear Discriminant Analysis, LDA）和决策树AUC=0.5。SVM-Linear风险评分在破裂斑块高于稳定斑块（p=0.006），Naive Bayes评分也高（p=0.015）。结论为NEW10特征捕捉ACS临床不稳定与形态学斑块破裂共享的转录特征，但为横断面判别，非未来事件预测。

讨论指出六亚群挑战传统M1/M2二分法；PLD4⁺和SPP1⁺分别呈炎症和破骨细胞样特征，MX1⁺可能为干扰素启动抗病毒状态；THBS1⁺缺氧和TGF-β信号提示位于低氧、纤维化小生境，FOSB调控子升高提示应激反应转录调控，但直接调控未证实；拟时序终末位置不等于确定谱系关系。CellChat预测THBS1⁺ MIF减弱、THBS增强，THBS1-CD36与LEC互作，但CellChat仅基于表达推断，不能证明蛋白结合、受体激活或生物后果；淋巴管功能随斑块阶段变化，THBS1也可能通过CD47调控LEC，因此需实验验证。SMS121-CD36计算预测需要表面等离子共振、细胞摄取和体内研究验证。机器学习显示NEW10可区分ACS与sCAD及破裂与稳定斑块，但两个队列结局定义不同，ACS和斑块破裂相关但不完全等同，且测试队列小，不能视为验证的临床风险评分。局限包括公共scRNA-seq样本量有限、无配对临床元数据、CellChat和FOSB调控为计算推断、机器学习结局定义不同、空间结构未解析；未来需前瞻性多中心队列、实验验证和空间转录组。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员在冠状动脉粥样硬化斑块中鉴定出六个转录上不同的巨噬细胞亚群，并将THBS1⁺亚群描述为终末分化、缺氧反应性和TGF-β富集的转录状态。CellChat分析预测THBS1⁺巨噬细胞与淋巴内皮细胞之间存在推定的THBS1-CD36相互作用，而分子对接和分子动力学模拟为SMS121与CD36之间的相互作用提供了初步计算支持，该相互作用需实验验证。THBS1⁺巨噬细胞相关的NEW10特征也在冠状动脉不稳定性的临床和形态学表现中显示出区分性能，尽管需要在更大型前瞻队列中验证。这些发现为进一步开展冠状动脉粥样硬化中巨噬细胞异质性的机制、药理学和转化研究提供了框架。