乙醇–水提取耦合超滤技术制备富含胭脂树橙（Bixin）提取物的研究

《Chemistry & Biodiversity》：Production of Bixin-Rich Extracts From Annatto Seeds via Ethanol–Water Extraction Integrated With Ultrafiltration Technology

　　

本研究探讨了将乙醇–水提取与超滤（Ultrafiltration）技术相结合，用于从胭脂树（Annatto）种子中提取并浓缩生物活性化合物的方法。研究人员采用乙醇与水的混合溶剂，实现了酚类化合物与类胡萝卜素化合物的共提取。所得胭脂树种子提取物中，胭脂树橙（Bixin）和总酚（Total Phenolics）的浓度分别为1.91 ± 0.02 mg g?1（干基）和52.31 ± 2.45 mg GAE g?1（干基）。随后，通过截留分子量（Molecular Weight Cut-off, MWCO）为5 kDa的膜进行超滤，有效浓缩了目标分子，膜对总酚的截留率（Membrane Rejection）为47.53 ± 0.22%，对胭脂树橙分子的截留率为97.90 ± 0.02%。初始渗透通量为28.59 L h?1 m?2，最终稳定在稳态通量9.26 L h?1 m?2。研究人员观察到，通量衰减在过滤初期主要以滤饼层形成（Cake Formation）污染机制为特征，而最终通量则由滤饼层形成与孔堵塞（Pore Blockage）机制共同描述。本研究凸显了膜技术在制备高质量胭脂树提取物方面的潜力，有助于推动其更广泛的工业应用。

论文解读

一、研究背景与问题

胭脂树（Bixa orellana L.）是一种原产于拉丁美洲的植物，其种子富含类胡萝卜素色素，主要成分为胭脂树橙（Bixin）和降胭脂树橙（Norbixin）。胭脂树橙已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为食品添加剂，广泛用于烘焙食品、冰淇淋、黄油、奶酪、谷物、人造奶油和肉类等产品的着色。目前，胭脂树产品约占全球类胡萝卜素市场的11.5%，预计市场规模将从2021年的19亿美元增长至2027年的27亿美元。除作为食品着色剂外，胭脂树橙还具有抗氧化、抗菌、降血糖、细胞毒性、抗炎和抗癌等多种有益健康特性。

胭脂树橙的广泛应用依赖于高效提取、浓缩和纯化工艺的开发。传统上，从胭脂树种子中获取胭脂树橙主要采用油脂萃取或碱性水溶液的固液萃取工艺。文献中亦报道了超声波辅助、微波辅助和超临界萃取等非常规提取方法。然而，绿色溶剂因环境影响小、工艺成本低且食品安全性高，更受青睐。乙醇作为一种公认安全（Generally Recognized as Safe, GRAS）的物质，已被建议作为胭脂树橙提取的溶剂。提取后通常需要进一步的浓缩和/或纯化步骤。膜分离工艺因其运行成本低、选择性高，常被用于各种生物活性化合物的纯化和浓缩。然而，以往对胭脂树种子加工的研究主要集中于通过溶剂选择或强化提取技术来改善胭脂树橙的提取效率，对提取液的下游浓缩和分级关注较少。尽管膜工艺已成功应用于其他植物基质中酚类、花青素和类胡萝卜素的浓缩，但在胭脂树加工中的应用研究仍十分有限。此前有研究采用10 kDa聚醚砜膜处理水基胭脂树种子提取物，但胭脂树橙的低水溶性限制了其在水相体系中的回收，而含乙醇的胭脂树提取物的膜处理，特别是针对胭脂树橙的选择性浓缩，尚未得到系统研究。

二、研究内容与意义

本研究的创新之处在于将乙醇–水提取与5 kDa超滤膜技术相结合，以促进胭脂树种子提取物中胭脂树橙的选择性浓缩，同时评估酚类化合物和抗氧化化合物的行为。研究对进料液和透过液的详细理化特性进行了考察，重点分析了关键生物活性化合物的浓度，包括胭脂树橙浓度、总酚含量（Total Phenolic Content, TPC）和抗氧化活性。此外，通过将实验通量数据拟合至数学模型，评估了提取液过滤过程中的主要污染机制。这些研究有望拓展胭脂树衍生化合物在各行业中的潜在应用。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：以50:50（v/v）乙醇–水混合溶剂，在60°C、固液比1:30（g/mL）条件下磁力搅拌提取1小时制备胭脂树种子提取液；采用截留分子量为5 kDa的商用平板聚醚砜（Polyethersulfone, PES）膜进行死端超滤（Dead-end Ultrafiltration），操作压力4 bar，目标体积浓缩因子为1.4；利用高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）定量胭脂树橙浓度；采用Folin–Ciocalteu比色法测定总酚含量；采用DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除法评估抗氧化活性；使用色差仪进行颜色分析；通过Hermia模型和串联阻力模型分析膜污染机理；利用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察膜表面污染层的形态。样本为商业化包装的胭脂树种子（Chamel, KittMed Laboratórios Ltda., Campo Largo, Paraná, Brazil; lot No. 14849），实验重复两次独立提取–超滤实验。

四、研究结果

4.1 膜超滤过程的通量分析

纯水和乙醇–水混合溶液（50:50, v/v）通过超滤膜的实验通量与跨膜压力呈线性关系（R2 > 0.99），符合达西定律。纯水透过系数为27.31 ± 0.90 L h^?1 m^?2 bar^?1，乙醇–水混合溶液的透过系数略降至25.80 ± 0.59 L h^?1 m^?2 bar^?1。在4 bar压力下过滤胭脂树种子提取液140分钟，渗透通量在最初10分钟内显著下降，随后趋于稳定，稳态渗透通量为9.26 ± 0.62 L h^?1 m^?2。采用Hermia模型分析发现，单一污染机理无法完整描述整个过滤过程的通量衰减。将过滤数据分为初始20分钟和20至140分钟两个阶段后，初始阶段以滤饼层形成（n = 0）为主要污染机理（R2 = 0.833），中间孔堵塞（n = 1）亦可能有所贡献；后期阶段各污染模型拟合效果相近，表明滤饼层形成和孔堵塞机理共同作用。串联阻力模型分析显示，膜固有阻力（R_m）、滤饼层阻力（R_c）和孔堵塞阻力（R_p）分别为（0.98 ± 0.002）、（1.07 ± 0.001）和（0.86 ± 0.003）×10¹² m^?1，滤饼层约占污染总阻力的55.4%，孔堵塞贡献44.6%。

4.2 进料液、透过液和浓缩液的理化特性

胭脂树种子提取液（进料液）的总酚含量为52.31 ± 2.45 mg_GAE g^?1（干基），抗氧化活性为365.9 ± 9.7 μmol_TE g^?1（干基），胭脂树橙浓度为1.91 ± 0.02 mg g^?1（干基）。超滤后，浓缩液中总酚含量为57.60 ± 2.70 mg_GAE g^?1，胭脂树橙浓度增至2.47 ± 0.12 mg g^?1，透过液中胭脂树橙浓度仅为0.04 ± 0.00 mg g^?1。膜对总酚的截留率为47.53 ± 0.22%，对胭脂树橙的截留率高达97.90 ± 0.02%。约94.2%的初始胭脂树橙质量回收于浓缩液中，胭脂树橙的富集因子（Enrichment Factor, EF）为1.29。透过液呈澄清透明状，亮度（L）较高，红色坐标（a）显著降低；浓缩液因a*坐标增大而呈现更强烈的红色。随时间变化的透过液分析显示，总酚含量和抗氧化活性随过滤时间呈上升趋势，透过液黄色逐渐加深，表明过滤后期有更多小分子溶质透过膜。质量平衡计算表明，总酚的残余质量（可能吸附于膜上）为6.41 ± 0.09%，胭脂树橙的未回收质量约为5.40 ± 0.01%。SEM分析显示，使用后的膜表面形成了平均厚度为24.25 ± 1.94 μm的致密滤饼层，表面沉积了大量直径约3 μm的球形颗粒和聚集体。

五、讨论与结论

研究人员指出，胭脂树橙的高截留率不能仅归因于分子尺寸排阻。胭脂树橙的分子量（约394.5 Da）远低于膜的标称截留分子量（5 kDa），表明其他分离机制亦发挥了作用。胭脂树橙具有长共轭烃链和强疏水性，在极性溶剂–水混合物中可形成分子聚集体，从而增大其有效流体动力学尺寸。此外，胭脂树种子中含有的脂质、蛋白质和碳水化合物等大分子或胶体组分可能与类胡萝卜素分子形成复合物或聚集体。胭脂树橙与膜表面以及过滤过程中逐渐沉积的有机物的相互作用，也可能进一步降低其透过膜的传输效率。致密滤饼层的形成提供了额外的选择性屏障，增加了溶质传输阻力。因此，高胭脂树橙截留率是分子聚集、溶质–膜相互作用和滤饼层附加阻力共同作用的结果。虽然滤饼层有利于胭脂树橙的截留，但其较大厚度也增加了水力阻力，导致渗透通量下降，并可能影响膜的清洗和重复使用。研究人员建议未来研究应关注错流过滤、跨膜压力和流体动力学条件优化以及进料预处理等策略，以控制过度滤饼层形成同时保持胭脂树橙截留率。研究还指出，超滤后透过液和浓缩液的乙醇浓度预计接近进料液（50 vol%），但未对残余乙醇浓度进行定量测定，也未进行溶剂脱除步骤，因此在食品、制药或化妆品应用前需进一步分析以符合安全和法规要求。从经济角度看，乙醇–水提取与超滤的集成在放大生产中具有吸引力，因为膜浓缩在相对低压下运行且无需相变，能耗可能低于热浓缩工艺。

研究结论为：本研究探讨了从胭脂树（B. orellana L.）种子中提取生物活性化合物并通过超滤进行浓缩的方法。所选的乙醇–水混合溶剂能有效回收酚类和类胡萝卜素化合物，所得提取物含胭脂树橙1.91 ± 0.02 mg g^?1和总酚52.31 ± 2.45 mg GAE g^?1（干基）。采用5 kDa聚醚砜膜的死端超滤促进了胭脂树橙的浓缩，同时允许酚类化合物部分透过。膜对胭脂树橙的截留率高达97.90 ± 0.02%，胭脂树橙浓度从1.91 ± 0.02增至2.47 ± 0.12 mg g^?1（干基），对应富集因子1.29。相比之下，总酚的截留率较低，为47.53 ± 0.22%。Hermia模型分析显示，超滤初期以滤饼层形成为主要污染类型，后期各污染机理均对通量衰减有贡献。渗透通量降至稳态值9.26 ± 0.62 L h^?1 m^?2，滤饼层形成占总污染阻力的55.4%。超滤过程能有效浓缩胭脂树橙分子，而总酚仅被部分截留。这些定量结果证明了所提出工艺的选择性特征，特别是用于生产富含胭脂树橙的胭脂树提取物。在应用于食品、制药或化妆品产品之前，还需进一步研究溶剂回收、污染控制、工艺放大以及最终提取物的安全和法规要求。