海洋来源 Streptomyces polyantibioticus S4D258 新放线菌素类似物 H1–H15 的结构解析及其抗三阴性乳腺癌增殖与凋亡/铁死亡机制研究

《Chemistry & Biodiversity》：Actinomycin Analogs From Streptomyces polyantibioticus S4D258: Structural Elucidation and Antiproliferative Activity Against Triple-Negative Breast Cancer

从海洋来源的 Streptomyces polyantibioticus S4D258 中获得15个新的放线菌素类似物。通过高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESIMS）、核磁共振波谱（NMR）和 Marfey's 方法的综合分析，成功实现了这些化合物的结构解析。值得注意的是，放线菌素 H₁–H₅（1–5）含有 L-丝氨酸（L-Ser）、D-2-氨基丁酸（D-2-Aba）和 L-2-甲氨基丁酸（L-2-MeAba）残基，而放线菌素 H₆（6）包含一个 5H-噁唑并[4,5-b]吩噁嗪发色团。放线菌素 H₇–H₁₅（7–15）是九个截短放线菌素类似物，仅含有一个五肽内酯单元。放线菌素 H₁（1）和 H₉（9）对三阴性乳腺癌（TNBC）MDA-MB-231细胞增殖表现出抑制活性，IC₅₀值分别为28.00 nM和4.34 μM。机制研究显示，上述两种放线菌素类似物不仅诱导 S 期阻滞、线粒体膜电位去极化及凋亡，还触发铁死亡，表现为活性氧（ROS）、脂质过氧化和丙二醛（MDA）水平升高。总之，研究人员的发现丰富了天然放线菌素的结构多样性，并启发了对放线菌素类似物作为抗 TNBC 抗癌先导化合物的重新审视。

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）约占乳腺癌的15%至20%，其侵袭性病理特征和转移倾向导致预后较其他乳腺癌亚型更差。由于缺乏可靠生物标志物，TNBC临床治疗仍依赖细胞毒药物，包括蒽环类、紫杉烷类和铂类化合物，但耐药性限制了临床获益，因此亟需高效、低毒且具新作用机制的新药。放线菌素（actinomycins）主要由 Streptomyces 产生，是色肽抗生素，分子由保守的三环吩噁嗪酮（phenoxazinone）核心与两个五肽内酯（pentapeptidolactone）环（α-环和β-环）通过两个酰胺键连接组成。该类化合物具有抗肿瘤和抗菌活性，其发色团插入双链DNA的G–C和C–G碱基对之间，两个五肽内酯环占据小沟，形成稳定DNA–配体复合物以阻断转录。代表性放线菌素D用于妊娠滋养细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、Wilms瘤和Ewing肉瘤等联合化疗，但剂量限制毒性和耐药性限制其广泛应用。自1940年发现首个放线菌素以来，已报道近40个成员，结构多样性主要源于两个五肽内酯环的氨基酸残基组成差异；截短类似物 hemiactinomycin 仅含一个五肽内酯单元，提示经典双五肽内酯框架并非绝对保守，但截短放线菌素的结构可塑性仍未被充分探索。为寻找新的抗TNBC化合物，研究人员从海洋放线菌中开展天然产物发现与活性评价。

研究人员从海洋来源的 Streptomyces polyantibioticus S4D258 中获得了15个新的放线菌素类似物，命名为放线菌素 H₁–H₁₅（1–15）。这些类似物或在五肽内酯环中引入非典型氨基酸残基，如4-羟基脯氨酸（Hyp）、Ser、2-Aba和2-MeAba，或为仅含一个五肽内酯单元的截短放线菌素。放线菌素 H₁（1）和 H₉（9）可抑制MDA-MB-231细胞增殖并诱导S期阻滞，进一步机制研究显示二者诱导凋亡和铁死亡，提示其作为新型抗TNBC先导结构的潜力。研究报道了15个放线菌素类似物的结构解析和抗TNBC活性，并对 H₁（1）和 H₉（9）进行了抗癌机制研究。

关键技术方法概括如下：以海洋来源 Streptomyces polyantibioticus S4D258 为研究对象，该菌株由 Prof. Gaiyun Zhang 在 Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, China 从南海沉积物分离；采用 HR-ESIMS、NMR、紫外光谱、旋光及 Marfey's 分析进行结构解析与绝对构型归属；以半制备和分析型HPLC、LC–MS进行分离纯化；使用MDA-MB-231（RRID: CVCL_0062）和4T1（RRID: CVCL_0125）TNBC细胞，细胞购自 Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences（Shanghai, China）；通过CCK-8、PI细胞周期、Annexin V-FITC/PI凋亡、JC-1线粒体膜电位、BODIPY 581/591 C₁₁脂质过氧化、DCFH-DA ROS及TBARS MDA检测，并进行Fer-1挽救实验。

研究结果如下。化合物1（放线菌素 H₁）：红色无定形粉末，分子式为 C₆₁H₈₄N₁₂O₁₆，HR-ESIMS给出 m/z 1241.6220 [M + H]⁺。NMR显示存在吩噁嗪酮发色团和两个五肽内酯部分；α-环序列为 Val、Pro、Sar、2-MeAba、Thr，β-环为 Val、Pro、Sar、MeVal、Thr，Marfey's 分析指定为 D-Val、L-MeVal、L-2-MeAba、L-Thr、L-Pro及非手性Sar。UV吸收与放线菌素D相似，结构为含 L-2-MeAba 于α-环的新类似物。化合物2（放线菌素 H₂）：同分子式，α-环含 MeVal，β-环含 2-MeAba，即 L-2-MeAba 位于β-环；研究人员提出该位置差异可能与 nonribosomal peptide synthetase（NRPS）的底物宽泛性有关。化合物3（放线菌素 H₃）：同分子式，α-环含 L-Ser，β-环含 MeVal 和 Thr，为含 L-Ser 于α-环的新类似物。化合物4（放线菌素 H₄）：同分子式，α-环含 D-2-Aba，β-环为 Val、Pro、Sar、MeVal、Thr，为含 D-2-Aba 于α-环的新类似物。化合物5（放线菌素 H₅）：分子式 C₆₁H₈₄N₁₂O₁₇，α-环为 Val、Pro、Sar、MeVal、Thr，β-环含 Hyp、Ser，为含 L-Ser 和 L-Hyp 于β-环的新类似物。化合物6（放线菌素 H₆）：分子式 C₆₇H₉₀N₁₂O₁₉，含四环发色团和两个五肽内酯部分；其发色团为 5H-oxazolo[4,5-b]phenoxazine，并带4-氧代丁酸侧链，与放线菌素D₁类似但UV和分子量不同。化合物7（放线菌素 H₇）：分子式 C₃₇H₄₉N₇O₁₁，含双环发色团和一个五肽内酯部分；发色团为带3-甲基-2-氧代丁-3-烯酰胺侧链的8-甲基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮骨架。化合物8（放线菌素 H₈）：分子式 C₃₆H₄₈N₆O₁₁，含苯并噁嗪酮发色团和一个五肽内酯部分，发色团带丙烯酸侧链。化合物9（放线菌素 H₉）：分子式 C₃₇H₅₀N₆O₁₁，含苯并噁嗪酮发色团和一个五肽内酯部分，发色团带丙烯酸甲酯侧链。化合物10（放线菌素 H₁₀）：分子式 C₃₆H₄₉N₇O₁₀，含苯并噁嗪酮发色团和一个五肽内酯部分，发色团带丙烯酰胺侧链。化合物11（放线菌素 H₁₁）：分子式 C₂₆H₄₁N₅O₉，为截短类似物，含一个五肽内酯部分，Thr残基N端连接2-甲氧基-2-氧代乙酰基。化合物12（放线菌素 H₁₂）：分子式 C₂₅H₃₉N₅O₉，Thr残基N端连接草酰基。化合物13（放线菌素 H₁₃）：分子式 C₂₅H₄₀N₆O₈，Thr残基N端连接2-氨基-2-氧代乙酰基；11–13共享截短支架但N端修饰不同，提示发酵或分离过程中可能发生降解或转化。化合物14（放线菌素 H₁₄）：分子式 C₃₁H₄₄N₆O₉，含单环发色团2-氨基-6-甲基环己-2,5-二烯-1,4-二酮和一个五肽内酯部分。化合物15（放线菌素 H₁₅）：分子式 C₃₂H₄₄N₆O₉，含双环发色团7-甲基苯并[d]噁唑-2(3H)-酮和一个五肽内酯部分。

抗增殖活性结果显示，研究人员采用人MDA-MB-231和小鼠4T1 TNBC细胞系，通过CCK-8评估所有化合物的抗增殖作用。化合物1–6和9对两种细胞系均表现出抗增殖活性。在MDA-MB-231细胞中，1–6的抗增殖活性强于截短类似物9，其中化合物4活性最强，IC₅₀为11.89 nM。初步构效关系（SAR）表明，含两个五肽内酯部分的1–6具有显著抗增殖活性，而截短类似物7–15中仅9保留显著活性。基于此，研究人员选择1和9进一步机制研究，分别代表含两个五肽内酯部分的放线菌素类似物和截短放线菌素类似物；尽管1的抑制活性弱于4，但因1和2为位置异构体，仅 L-2-MeAba 位置不同，故1也被选入。细胞周期分析显示，1和9处理诱导MDA-MB-231细胞明显S期积累并降低G₀/G₁期细胞群体，提示细胞周期破坏可能贡献其抗增殖效应。凋亡分析通过流式细胞术显示，1和9处理后凋亡细胞比例增加；JC-1染色显示绿色荧光增强，表明线粒体膜电位消散和早期凋亡改变，提示线粒体功能障碍可能参与1和9诱导的凋亡。铁死亡相关检测显示，BODIPY 581/591 C₁₁染色表明1和9显著增加脂质过氧化，DCFH-DA染色显示ROS浓度依赖性升高，TBARS检测显示胞内MDA水平显著增加；铁死亡抑制剂 ferrostatin-1（Fer-1）可显著恢复1和9处理后的细胞活力。ROS、脂质过氧化和MDA协调升高以及Fer-1挽救效应支持铁死亡参与1和9诱导的细胞死亡。综上，1和9通过S期阻滞抑制TNBC细胞生长，并通过凋亡和铁死亡诱导细胞死亡。

讨论与结论部分总结：本研究丰富了天然放线菌素的结构多样性，尤其是截短放线菌素类似物，并支持放线菌素类似物作为抗TNBC先导化合物的再评价。研究结论翻译如下：总之，从 S. polyantibioticus S4D258 中鉴定出15个新的放线菌素类似物，命名为放线菌素 H₁–H₁₅。这些化合物的结构差异在于五肽内酯部分。放线菌素 H₇–H₁₅ 是截短放线菌素类似物。放线菌素 H₁–H₆（1–6）和 H₉（9）对 MDA-MB-231 和 4T1 TNBC 细胞均表现出显著抗增殖活性。机制研究揭示，放线菌素 H₁（1）和 H₉（9）诱导 S 期阻滞、凋亡和线粒体膜电位破坏。此外，两种化合物处理增加细胞内 ROS，促进脂质过氧化，并升高丙二醛水平，而 ferrostatin-1 逆转细胞毒性作用，提示铁死亡参与这些化合物的抗癌作用。总的来说，这些化合物拓宽了天然放线菌素的化学多样性，并支持其作为潜在抗 TNBC 先导化合物的进一步探索。