《Environmental Microbiology》：Assessing the Use of Oxford Nanopore Technologies Sequencing for Detection of Stable Wolbachia Bacterial Strain in Symbiosis in Wild Anopheles Mosquitoes From the WHO African Region
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疟疾仍然是重大的全球健康挑战，2023年报告了2.63亿例病例。按蚊（Anopheles）的杀虫剂抗性威胁着当前的媒介控制方法，亟需新的策略来对抗疟疾传播。沃尔巴克氏菌（Wolbachia）是一种内共生细菌，能够入侵蚊虫种群并抑制病原体复制，但直
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疟疾仍然是重大的全球健康挑战，2023年报告了2.63亿例病例。按蚊（Anopheles）的杀虫剂抗性威胁着当前的媒介控制方法，亟需新的策略来对抗疟疾传播。沃尔巴克氏菌（Wolbachia）是一种内共生细菌，能够入侵蚊虫种群并抑制病原体复制，但直到近期才被证实是两种野生按蚊中的高密度共生菌。检测与按蚊共生的沃尔巴克氏菌一直依赖于沃尔巴克氏菌基因的PCR扩增和/或Sanger及Illumina测序。本研究评估了牛津纳米孔测序技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）检测沃尔巴克氏菌的可行性，该技术有望在疟疾流行环境中促进野生按蚊共生菌的筛查。研究人员使用了46个样本，其中10个样本合并进行单次MinION流槽运行，其余样本使用Flongle流槽单独处理，比较了三种蚊种与三种试剂盒组合。使用ONT现场测序试剂盒时，An. demeilloni（真正的共生关系）中沃尔巴克氏菌的读数比An. gambiae（无沃尔巴克氏菌证据）多13倍。随后使用更经济的Flongle流槽评估了ONT 16S条形码试剂盒和快速条形码试剂盒。沃尔巴克氏菌在An. demeilloni和An. moucheti中被成功鉴定，但在An. gambiae中未被检出。本研究证明了ONT在野外环境中检测沃尔巴克氏菌的可行性。
论文解读文章
一、研究背景与意义
疟疾是由疟原虫（Plasmodium）寄生虫引起、通过感染按蚊（Anopheles）叮咬传播的重大传染病，2023年全球估计有2.63亿病例和59.7万死亡。尽管疫苗研发取得了令人鼓舞的进展，但按蚊的杀虫剂抗性已削弱了传统媒介控制措施的有效性。沃尔巴克氏菌（Wolbachia）作为一种内共生细菌，可通过胞质不相容性（cytoplasmic incompatibility, CI）等表型适应机制入侵蚊虫种群并抑制病原体复制，为按蚊的生物防治提供了极具吸引力的新策略。在伊蚊（Aedes aegypti）中，沃尔巴克氏菌已被成功应用于抑制登革热等虫媒病毒的传播，且被证明安全有效。然而，将这一策略转化到按蚊面临诸多挑战，其中一个关键瓶颈是历史上认为野生按蚊种群中不存在天然的沃尔巴克氏菌共生。研究人员近期在An. moucheti（wAnM株）和An. demeilloni（wAnD株）中发现了真正的内共生沃尔巴克氏菌株，并在蚊虫卵巢中可视化验证，但主要疟疾媒介按蚊中尚无真正共生的沃尔巴克氏菌证据。当前沃尔巴克氏菌的检测方法包括PCR扩增特异性基因和荧光原位杂交等，但这些方法成本高、耗时且需要大量基础设施，Illumina和Sanger测序同样因成本高昂、需要将样本运送到境外测序机构而受到限制。因此，开发一种可在疟疾流行地区的野外环境中部署的快速、经济且简便的检测方法，对于沃尔巴克氏菌菌株的鉴定、表型特征评估和自然种群监测至关重要。牛津纳米孔测序技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）以其便携性、实时测序能力和最低限度的设备要求，为在资源有限的WHO非洲区域实验室实现“本地化”测序提供了可能。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从刚果民主共和国（DRC）、肯尼亚和喀麦隆采集了三种按蚊（An. demeilloni、An. gambiae和An. moucheti）的成年雌性样本，经形态学鉴定后储存于-70°C。使用Qiagen DNeasy试剂盒提取基因组DNA（gDNA），并以单只或合并池（pool）形式进行文库制备。研究评估了三种ONT文库制备方案：ONT现场测序试剂盒（Field sequencing kit, SQK-LRK001）配合MinION流槽（FLO-MIN004RA）在Mk1C设备上运行；ONT快速PCR条形码试剂盒24 V14（Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14, SQK-RPB114.24）和16S条形码试剂盒24 V14（16S Barcoding Kit 24 V14, SQK-16S114.24）配合更经济的Flongle流槽（FLO-FLG114）在Mk1B设备上运行。测序数据分析采用EPI2ME平台的WIMP（What's In My Pot）工作流程（基于Centrifuge分类方法）和SituSeq流程（采用DADA2和Silva数据库进行16S rRNA分类学分配）。
三、研究结果
3.1 文库制备试剂盒的总测序数据输出比较
使用现场测序试剂盒在MinION Mk1C上对合并池样本（n=10）测序，An. demeilloni（样本AN.DEM.DRC.2022.P10）总读数为139,950，An. gambiae（样本AN.GAM.DRC.2022.P10）为72,659，两者分类读数比例相近（分别为46.1%和42.7%），且细菌读数均超过60%。由于现场测序试剂盒需要超过10只蚊虫合并才能获得足够的gDNA，且该试剂盒和Mk1C设备已停产，研究转而使用两种条形码试剂盒在Flongle流槽上评估。11次测序运行中10次成功（91%），仅1次失败。快速PCR条形码试剂盒平均产生5.9 Gb数据，16S条形码试剂盒平均仅1.5 Gb；总读数分别为148,034和63,854。然而，16S条形码试剂盒的最成功运行（第7次）产生了254,340个读数。无论使用哪种试剂盒，沃尔巴克氏菌都是样本AN.MOU.CAM.2019.P1.2中最丰富的分类群。
3.2 碱基检出失败率
以最低质量分数9为通过标准，快速PCR条形码试剂盒的平均碱基检出失败率为10.8%，而16S条形码试剂盒为28.8%。排除第9次运行（可能是技术错误导致，失败率达86%）后，16S条形码试剂盒的失败率仍为14.3%。快速PCR条形码试剂盒的未分类读数和碱基比例分别为5.16%和4.16%，而16S条形码试剂盒分别高达27.24%和14.02%，表明16S条形码试剂盒在条形码识别方面损失了更多数据。使用Flongle流槽时，同时运行的最大样本数估计为4个，超过此数量则无法产生足够高的读数。
3.3 ONT测序比较
将现场测序试剂盒（MinION流槽R9.4.1）与快速PCR条形码试剂盒（Flongle流槽FLO-FLG114）在相同24小时运行时长下比较，MinION流槽理论上产生的数据量约为Flongle的18.5倍，但Flongle运行中有3次（第4、5、6次）实现了更大的数据量。快速PCR条形码试剂盒的5次运行中有4次（80%）产生的碱基数超过MinION流槽。MinION流槽实现了100%的读数检出率，而Flongle运行中最高仅为95.71%，最低仅8.74%（第4次）。MinION流槽的通过碱基数高于任何Flongle运行，但Flongle流槽在估计碱基数、生成读数和总数据产出方面与MinION相当。
3.4 整体微生物组相对丰度
使用16S条形码试剂盒测序的文库经WIMP流程分析，An. moucheti（样本AN.MOU.CAM.2024.P1）的四个重复条形码产生了高度一致的微生物组图谱，沃尔巴克氏菌是最优势菌属，肠杆菌属（Enterobacter）、埃希氏菌属（Escherichia）和克雷伯菌属（Klebsiella）也是重要菌属。SituSeq流程分析结果与EPI2ME一致。跨物种比较显示，沃尔巴克氏菌在An. moucheti和An. demeilloni微生物组中占主导地位，但在An. gambiae中未被检出；相反，Asaia属在An. gambiae中相对丰度最高（超过50%），而在其他两种按蚊中未检出。Enterobacter在样本AN.MOU.CAM.2024.P1中丰度较高。SituSeq流程在An. gambiae中还检出了较高丰度的Swaminathania属，而EPI2ME分析未检出该属。
3.5 使用ONT检测沃尔巴克氏菌
现场测序试剂盒文库在MinION Mk1C上测序，An. demeilloni合并池（AN.DEM.DRC.2022.P10）总读数139,950中69%为细菌，沃尔巴克氏菌794个读数（占总读数0.57%），Asaia属182个读数。An. gambiae合并池（AN.GAM.DRC.2022.P10）总读数72,659中60%为细菌，仅30个沃尔巴克氏菌读数（占0.04%）。An. demeilloni中沃尔巴克氏菌读数比An. gambiae丰富约13倍，与定量PCR和16S rRNA测序结果一致。使用Flongle流槽时，快速PCR条形码试剂盒在An. demeilloni和An. moucheti中平均检出42个沃尔巴克氏菌读数，而16S条形码试剂盒平均检出2038个读数，丰度（沃尔巴克氏菌/总读数）分别为0.006和0.42。两种文库制备方法在An. gambiae中均未检出沃尔巴克氏菌，与常规PCR方法确认的感染状态一致。
四、讨论与结论
研究表明，使用16S条形码试剂盒配合Flongle流槽是在按蚊中检测沃尔巴克氏菌的最优方案，因其靶向细菌16S rRNA基因而非全基因组，平均检出2038个沃尔巴克氏菌读数，并能提供与Illumina 16S rRNA扩增子测序一致的稳定微生物组图谱。An. gambiae中沃尔巴克氏菌的缺失与Asaia的高丰度并存，为两种细菌间的潜在竞争性互斥提供了进一步证据。研究存在一些方法学局限：快速条形码文库制备的PCR循环数从推荐的14次增加到25次，可能增加非特异性扩增和嵌合体形成的风险，但An. gambiae阴性对照未产生沃尔巴克氏菌读数，排除了假阳性可能；不同测序运行和样本间沃尔巴克氏菌读数存在变异，可能受起始DNA质量、流槽可用孔数和样本间感染密度差异影响，因此该方法应主要用于定性检测而非精确定量。16S条形码试剂盒在野外使用仍需要热循环仪、磁力架等设备，且Flongle流槽运行需要至少1 TB存储的计算能力，限制了其在最偏远地区的应用。结论指出，疟疾对WHO非洲区域造成不成比例的负担，一种经济可行的“现场”微生物组测序方法对于开发基于沃尔巴克氏菌的新型媒介控制策略至关重要。ONT具有可变读长和超长读长（>1 Mb）的优势，未来可用于快速测序野生按蚊种群中沃尔巴克氏菌菌株的完整基因组，目前仅有两种菌株完成了基因组测序。
