《Matrix Biology》：Degradomic and transcriptomic profiling reveal pleiotropic roles of extracellular granzyme B in scarring and fibrosis
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颗粒酶B（Granzyme B，GzmB）是一种具有天冬氨酸酶样（aspase-like）活性的丝氨酸蛋白酶，传统上被认为主要发挥细胞毒性功能。在免疫突触形成过程中，颗粒酶B主要由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生，其向靶细胞胞质内的递送由成孔蛋白穿孔素（p
颗粒酶B（Granzyme B，GzmB）是一种具有天冬氨酸酶样（aspase-like）活性的丝氨酸蛋白酶，传统上被认为主要发挥细胞毒性功能。在免疫突触形成过程中，颗粒酶B主要由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生，其向靶细胞胞质内的递送由成孔蛋白穿孔素（perforin）所介导。一旦被内化，颗粒酶B通过切割胞内底物，促进半胱天冬酶（caspase）依赖性和非依赖性细胞凋亡以及焦亡。然而，颗粒酶B可从免疫突触中泄漏、由细胞毒性细胞分泌，或由穿孔素缺陷的免疫细胞和非免疫细胞产生，在特定炎症条件下可在细胞外空间蓄积。在细胞外微环境中，由于人类缺乏内源性细胞外抑制剂，颗粒酶B保留其蛋白水解活性，并通过切割多种底物促进自身抗原生成、细胞黏附破坏、血管通透性增加、细胞因子加工以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑。
虽然已有报道指出颗粒酶B介导的ECM重塑可改变组织生物力学特性（尤其在皮肤病学相关背景下），但其亦可促进具有生物活性的ECM片段释放。值得注意的是，颗粒酶B对纤连蛋白（fibronectin）的切割可释放ECM结合的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），并产生可刺激真皮成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1的纤连蛋白片段。颗粒酶B还可通过切割转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用蛋白聚糖（如核心蛋白聚糖decorin、双糖链蛋白聚糖biglycan和β聚糖betaglycan），促进主要促纤维化细胞因子TGF-β的释放和激活。然而，细胞外颗粒酶B蛋白水解的完整底物谱及其功能/病理学后果仍知之甚少。
多项研究表明颗粒酶B通过ECM重塑在心脏、视网膜下、肾脏和皮肤纤维化中发挥重要作用。颗粒酶B在人纤维化心脏中显著上调，其基因消融可减少血管紧张素II诱导的心脏纤维化动物模型中的ECM蓄积。在两步激光诱导的小鼠视网膜下纤维化模型中也观察到类似结果，颗粒酶B基因敲除动物表现出与I型胶原沉积减少相关的病灶面积缩小。研究人员所在团队还报道了瘢痕疙瘩和增生性瘢痕患者真皮中表达颗粒酶B的肥大细胞蓄积。在此背景下，颗粒酶B切割LTBP1（潜在TGF-β结合蛋白-1，latent TGF-β binding protein-1）——一种参与细胞外锚定潜在TGF-β的结构性ECM分子——导致其激活并诱导真皮成纤维细胞中TGF-β/Smad信号通路。最后，在热损伤小鼠模型中，局部应用高特异性小分子细胞外颗粒酶B抑制剂VTI-1002通过阻止核心蛋白聚糖切割并改善皮肤拉伸强度来延缓伤口闭合。尽管越来越多的证据支持颗粒酶B在纤维化中的致病作用，但迄今为止，尚未有大规模组学、系统生物学方法被用于全面表征细胞外颗粒酶B所调控的分子机制。
在本研究中，研究人员通过采用N端组学（N-terminomics，1小时，用于鉴定早期颗粒酶B底物及其切割位点）和转录组学（transcriptomics，6小时，用于鉴定颗粒酶B诱导信号传导所产生的后期转录变化），在系统水平上表征了细胞外颗粒酶B对原代人真皮成纤维细胞的影响。关键的ECM重塑酶——以及参与结缔组织组织和细胞外生长因子生物利用度调节的结构性和非结构性ECM分子——被鉴定为颗粒酶B底物，并在体外和离体模型中得以验证。RNA测序鉴定出颗粒酶B处理的原代人真皮成纤维细胞中TGF-β样转录组反应和多种促炎通路的上调。在数据驱动的生物信息学方法指导下，颗粒酶B降解组和转录组特征在体内人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩以及疾病相关的小鼠热损伤模型中于蛋白水平得到进一步验证。总而言之，本研究结果 delineate 了颗粒酶B在ECM重塑、生长因子激活和炎症中的新机制，支持将颗粒酶B抑制作为热损伤、增生性瘢痕和纤维化的治疗策略。
论文解读：细胞外颗粒酶B在瘢痕形成与纤维化中的多效性作用
一、研究背景与科学问题
瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是由创伤、烧伤或炎症引发的结缔组织反应所致的纤维增生性伤口愈合缺陷，其特征为真皮层ECM过度蓄积，常伴有瘙痒和疼痛，显著降低患者生活质量。在瘢痕形成的病理机制中，长期炎症反应导致的细胞外蛋白酶蓄积被认为是纤维化发生和进展的潜在驱动因素。尽管MMPs在瘢痕和纤维化研究中受到广泛关注，但其治疗潜力仍然有限，主要归因于抑制剂缺乏特异性以及MMPs在趋化因子调节和免疫抑制中的关键作用。
颗粒酶B（GzmB）是一种具有天冬氨酸酶样活性的丝氨酸蛋白酶，传统上被认为主要发挥细胞毒性功能。然而，越来越多的证据支持GzmB在纤维化中的致病作用：GzmB在人纤维化心脏中显著上调，其基因消融可减少动物模型中的ECM蓄积；在视网膜下纤维化模型和皮肤瘢痕中也观察到类似发现。研究团队此前报道了瘢痕疙瘩和增生性瘢痕患者真皮中GzmB表达肥大细胞的蓄积，并发现GzmB可切割LTBP1导致TGF-β激活。然而，迄今为止尚未有大规模组学、系统生物学方法被用于全面表征细胞外GzmB调控的分子机制，其完整的底物谱及功能/病理学后果仍不清楚。因此，本研究旨在通过系统生物学方法，全面解析细胞外GzmB在真皮成纤维细胞中的蛋白水解底物及其下游转录效应，并验证其在瘢痕和纤维化疾病中的病理意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用系统生物学策略，将蛋白质组学（N端组学/TAILS，1小时处理）与转录组学（RNA测序，6小时处理）相结合，对GzmB处理的原代人真皮成纤维细胞进行全面分析。通过TAILS分析鉴定早期GzmB直接底物及其切割位点，通过RNA测序鉴定GzmB诱导信号传导产生的下游转录变化，并在体外、离体和体内模型中验证关键发现。研究最终在人类增生性瘢痕、瘢痕疙瘩以及热损伤小鼠模型中验证了GzmB降解组和转录组特征的病理相关性，确立了GzmB作为瘢痕和纤维化关键介质的作用。
三、关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：TAILS（末端胺同位素标记底物）N端组学分析，用于鉴定GzmB的直接蛋白水解底物及切割位点；RNA测序（RNA-seq）转录组学分析，用于鉴定GzmB处理后的差异表达基因和信号通路；GSEA（基因集富集分析）和CytoSig平台用于信号通路和细胞因子活性推断；体外切割实验和Western blot验证GzmB对特定底物的切割；免疫荧光和免疫组织化学用于蛋白水平的组织和细胞定位检测；利用公开数据集GSE178411（包含烧伤和增生性瘢痕患者bulk RNA-seq数据）进行疾病关联分析；以及使用糖尿病db/db小鼠热损伤模型进行体内药理学验证（VTI-1002为特异性细胞外GzmB抑制剂）。人类皮肤活检样本（健康皮肤、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕）来自不列颠哥伦比亚大学临床研究伦理委员会批准的采集。
四、研究结果
1. GzmB切割人真皮成纤维细胞产生的核心基质体ECM蛋白
TAILS分析在GzmB处理的成纤维细胞条件培养基中鉴定出236个显著富集的N端，其中164个N端（来自94个独特蛋白）在P1位点显示天冬氨酸[D]或谷氨酸[E]，符合GzmB的天冬氨酸酶样活性特征，代表潜在的直接底物。GO分析显示这些底物显著富集于细胞外区域、ECM和胶原蛋白相关类别。鉴定的底物包括多种纤维状和非纤维状胶原蛋白（I、III、IV、V、VI、XII、XVI和XVIII型）、糖蛋白（AEBP1、fibrillins、纤连蛋白、fibulin、LTBPs、thrombospondins、tenascin-X和玻连蛋白）和蛋白聚糖（CSPG4、versican）。蛋白-蛋白相互作用富集分析将底物分为5个亚群：胶原蛋白及相关酶、分子伴侣和细胞黏附蛋白、ECM-受体相互作用蛋白、弹性纤维相关核心基质体蛋白、以及参与生长因子/TGF-β细胞外锚定的蛋白。研究还确认了此前已报道的GzmB底物，包括fibrillin-1、纤连蛋白、laminin α4/γ1、LTBP1、syndecan-1、胶原IV、TSP1和TSP2。
2. GzmB切割可溶性和ECM来源的I型胶原、VI型胶原和Tenascin-X
TAILS结果显示GzmB主要在螺旋区切割I型和VI型胶原，并在TNX的第6个纤连蛋白III型重复上存在唯一切割位点。体外切割实验证实GzmB可切割成纤维细胞分泌的可溶性I型胶原（产生35 kDa片段）、VI型胶原（产生约60、30和20 kDa片段）和TNX（释放约245和35 kDa含C端纤维蛋白原样结构域的片段）。在脱细胞成纤维细胞ECM消化实验中，GzmB可从ECM中释放特异性I型胶原（35 kDa）、VI型胶原（110 kDa）和TNX（245/150 kDa）片段。离体人皮肤消化实验进一步证实GzmB可切割皮肤中的I型胶原、VI型胶原和TNX，释放的片段分子量与体外实验结果一致。此外，TAILS还鉴定出GzmB切割α1(III)、α1(V)、α1(XII)、α1(XVI)和α1(XVIII)胶原以及多种胶原相互作用蛋白（SPARC、SerpinH1、AEBP1）。
3. GzmB通过切割细胞外金属蛋白酶影响蛋白酶网络
TAILS分析鉴定出GzmB处理成纤维细胞条件培养基中MMP-1（两个新N端）、MMP-7（一个）和BMP-1（一个）的新N端上调。GzmB在MMP-1和MMP-7的催化结构域内切割，其中MMP-1在催化结构域末端位置252（D↓DIDG）被切割，去除参与底物特异性调控的血红素结合蛋白结构域。Western blot证实GzmB处理产生约25 kDa的两个MMP-1片段。BMP-1的切割位点位于其前结构域，可能不影响其成熟或蛋白水解活性。这些结果表明细胞外GzmB正在破坏紧密调控的蛋白酶网络。
4. GzmB切割生长因子结合蛋白以促进人真皮成纤维细胞中促炎和TGF-β样转录组反应
GO分析（MF数据库）显示GzmB底物包括一组生长因子结合蛋白：切割与PDGF相互作用的胶原蛋白（α1(I)、α2(I)、α1(III)、α1(V)、α1(VI)）；IGFBP3、IGFBP5和IGFBP6（结合胰岛素样生长因子）；LTBP2（与生长分化因子相关）；NRP1和CCN1（与VEGF相关）；以及LTBP1和TSP1（与TGF-β亚型相互作用）。RNA测序分析显示，在17904个基因中，27个显著上调和7个显著下调（Padj<0.05，|Log2FC|≥1）。GSEA分析表明多个炎症相关hallmark通路（TNFα、IFNγ、IFNα、炎症反应和IL6/JAK-STAT）和TGF-β活性通路（TGF-β信号、上皮间质转化）显著上调。CytoSig分析进一步将GzmB转录组特征与多种促炎细胞因子（IL1β和α、TNFα、IL36、IL33、IL12、IL2和IL6）及TGF-β1相关联，同时显示PDGFB相关转录组特征下调。
5. GzmB诱导真皮成纤维细胞中TGF-β依赖的肌成纤维细胞标志物PMEPA1表达
Western blot显示GzmB可从成纤维细胞ECM中释放TGF-β1和VEGF。ELISA分析表明GzmB释放ECM捕获的TGF-β为潜伏形式而非生物活性形式。研究人员验证了PMEPA1（前列腺跨膜蛋白雄激素诱导蛋白1，TGF-β反应性肌成纤维细胞基因）在GzmB处理后显著上调（L2FC=1.41）。GzmB处理诱导TGF-β/Smad信号通路的瞬时激活和PMEPA1蛋白水平的持续升高。使用抗pan-TGF-β抗体可显著减少GzmB依赖的PMEPA1诱导，证明GzmB驱动的PMEPA1表达需要TGF-β激活。
6. GzmB在真皮成纤维细胞中协调复杂的炎症谱
GzmB处理诱导RelA/p65的双相磷酸化（1小时早期低幅度峰和12小时更显著的第二次峰）。ELISA检测显示GzmB处理的成纤维细胞上清中TNFα不可检测，表明GzmB通过TNFα非依赖机制激活NFκB信号通路。TNFAIP2（NFκB/p65下游蛋白）在GzmB处理后以时间依赖方式分泌。GzmB还促进TNFAIP3、RELB、IRAK2以及NFκB抑制剂α（NFKBIA）和ζ（NFKBIZ）的转录，表明存在潜在的炎症反馈抑制。
7. GzmB降解组和转录组特征在瘢痕、纤维化、烧伤和结缔组织疾病中汇聚
生物信息学分析显示GzmB降解组特征与伤口愈合缺陷相关的人类病理学术语显著关联（萎缩性瘢痕、香烟纸样瘢痕、皮肤非典型瘢痕、真皮萎缩和瘢痕形成）。DisGeNET分析将GzmB降解组特征与多种皮肤病学结缔组织疾病及纤维化疾病（子宫肌瘤、瘢痕疙瘩）相关联。利用共识GzmB转录组特征搜索公开数据集GSE178411，发现该特征在增生性瘢痕和早期/晚期烧伤创面中显著富集。免疫组化显示瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中TNX检测显著减少，PMEPA1在两种病变中均显著升高，TNFAIP2在增生性瘢痕中显著增加。在热损伤糖尿病小鼠模型中，局部应用GzmB抑制剂VTI-1002可显著减少PMEPA1阳性面积并增加TNX检测。
五、讨论与结论
讨论部分指出，GzmB通过ECM蛋白水解、TGF-β激活和炎症通路调节，成为纤维化和瘢痕形成的关键介质。GzmB切割多种核心基质体ECM蛋白，包括I型和VI型胶原及TNX，释放的35 kDa I型胶原片段在不同生物学背景下具有可重复性，可能作为GzmB靶向治疗患者分层的诊疗标志物。TNX切割与Ehlers-Danlos综合征等结缔组织疾病相关。GzmB通过切割生长因子结合蛋白释放TGF-β和VEGF，诱导TGF-β样转录组反应和促炎通路激活。研究结论支持将细胞外GzmB抑制作为热损伤、增生性瘢痕和纤维化的治疗策略，通过下调TGF-β激活/促纤维化活性，同时保留伤口愈合正常消退所需的其他激活机制。
