《Microchemical Journal》：Fluorogenic pre-column derivatization for ultrasensitive HPLC determination of pyrroloquinoline quinone in human milk and plasma
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•荧光丙酮衍生化技术使得PQQ的超灵敏HPLC-FL分析成为可能。•5-乙酰基-PQQ通过1H NMR和高分辨率ESI-MS进行了表征。•实现了亚纳米摩尔级别的检测（LOD 0.22?nM），无需LC–MS/MS的复杂步骤•基质匹配校准技术使得在人乳和血浆中测定PQQ成为可能。•
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荧光丙酮衍生化技术使得PQQ的超灵敏HPLC-FL分析成为可能。
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5-乙酰基-PQQ通过1H NMR和高分辨率ESI-MS进行了表征。
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实现了亚纳米摩尔级别的检测（LOD 0.22?nM），无需LC–MS/MS的复杂步骤
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基质匹配校准技术使得在人乳和血浆中测定PQQ成为可能。
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人乳中的PQQ浓度与血浆或母亲的生物标志物无相关性。
引言
吡咯喹啉醌（PQQ，4,5-二氢-4,5-二氧-1H-吡咯[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸）是一种可溶于水的醌类化合物，作为甲烷脱氢酶的辅因子存在[1]。PQQ被认为是继烟酰胺和黄素之后的第三种氧化还原辅因子[2], [3]。PQQ在氧化还原信号传导和线粒体功能中起着至关重要的作用，这对细胞稳态和能量产生至关重要。基于细胞的研究表明，PQQ可以通过CREB/PGC-1alpha信号途径以及SIRT1依赖的PGC-1alpha激活来促进线粒体的生成[4], [5]。此外，由于PQQ具有潜在的益处，包括抗氧化活性[6]、对抗组织损伤的保护作用[7]以及促进神经生长因子的合成[8]，因此受到了广泛关注。某些食物（如青椒和西兰花芽）含有较高浓度的PQQ；市场上也有含PQQ的膳食补充剂[9], [10], [11]。PQQ是哺乳动物最重要的营养素之一，它作为辅酶参与赖氨酸等必需氨基酸的分解[3]。喂食缺乏PQQ的小鼠会出现生长迟缓和生育能力下降等异常[12]。
由于人乳是婴儿的重要营养来源[13]，人乳中的PQQ可能对婴儿的发育有重要影响。多项研究报道了人乳中存在PQQ，强调了它对婴儿发育和健康的潜在重要性[14], [15], [16]；然而，关于其确切含量和意义的数据仍然有限。Kumazawa等人检测到各种食物（包括人乳）中的游离PQQ浓度范围为3.7–61?ng/g或ng/ml[16]。不过，该研究未提供人乳的具体数据。因此，需要一种高灵敏度的分析方法来确定生物样品（包括人乳）中PQQ的生物利用度。
除了作为辅因子外，PQQ还具有催化活性，能够从NADH或硫醇等供体接受电子，并在适当条件下被分子氧重新氧化，从而维持氧化还原循环[17]。这种化学性质已被用于分析信号放大[18], [19], [20]。最近的研究表明，PQQ可以催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的H2O2依赖性氧化，从而实现比色检测[21]。这些催化性质推动了针对PQQ及其传感格式的敏感分析方法的发展。
已经开发出了多种测定PQQ的方法，包括酶法[22]、免疫测定[23]、带有电化学检测（ECD）的高效液相色谱（HPLC）[24], [25]、带有紫外线检测的毛细管电泳（CE）[26]、带有质谱（GC–MS）[27]、[28]以及带有串联质谱（LC-MS/MS）的液相色谱[9]。然而，这些方法在生物样品中对PQQ的定量存在局限性。使用PQQ吸光度进行检测的HPLC和CE方法通常灵敏度较低。HPLC-ECD方法的缺点是共存的生物成分会降低电极性能和检测灵敏度。虽然基于MS的方法（如GC–MS和LC-MS/MS）具有高灵敏度，但需要复杂且昂贵的仪器。此前，我们开发了结合紫外线[20]或化学发光（CL）[19]的敏感HPLC方法来检测PQQ，这些方法基于醌的氧化还原反应循环。然而，这些方法需要三个泵和多种检测试剂来在HPLC系统中完成复杂的氧化还原反应。后一种方法的检测限为7.6?nM，相当于每次进样152 fmol，这不足以用于PQQ的生物分析。
Duine等人此前描述了通过硼氢化钠还原后用高碘酸钠氧化来检测PQQ的方法[29]。然而，这种方法涉及多个化学转化步骤，主要用于酶提取物和微生物培养上清液的检测，而非人生物流的验证分析。最近的研究进一步表明人们对改进PQQ测量方法保持着持续的兴趣。2022年，Sun等人利用UPLC-MS/MS方法对人血浆中的PQQ进行了测定，定量限为10?ng/mL；然而，该方法需要串联质谱仪器，且适用于高剂量毒代动力学研究[30]。2025年，Zhu等人研究了PQQ的天然荧光特性，用于对产生PQQ的微生物进行荧光激活细胞分离，而非在生物基质中进行色谱定量[31]。Xia等人还展示了PQQ的过氧化物酶模拟活性，用于比色传感[21]；然而，这一现象被用于碱性磷酸酶的测量，未应用于PQQ的生物分析。
以往关于PQQ的分析方法文献尚未建立适合检测复杂人生物基质中纳摩尔浓度内源性PQQ的定量分析方法。另一方面，荧光方法非常灵敏且简单，与色谱分离结合使用时选择性极高。因此，我们尝试开发了一种新型的GPLC-FL方法，通过荧光衍生化技术，使用简化的程序和仪器来高灵敏度地测量PQQ。
Kano等人利用丙酮与PQQ反应将其转化为5-乙酰基-PQQ，并通过254?nm处的HPLC-UV检测进行了研究[32]。他们的方法检测范围为1–20 uM。本研究首次在HPLC-FL中利用了这种衍生物的强荧光特性，优化了荧光条件及基质制备方法，实现了对人乳和血浆中PQQ的纳摩尔级检测。生成的5-乙酰基-PQQ在355和460?nm的激发和发射波长下发出强荧光，而PQQ本身的荧光较弱。
通过将优化的预柱荧光衍生化技术与基质特异性的C18固相萃取相结合，所提出的方法无需柱后试剂添加或专用质谱/化学发光仪器，即可使用常规HPLC-荧光系统进行PQQ检测。该方法具备非常高的灵敏度，能够准确测量人乳和血浆中的PQQ浓度。这一信号转换策略提高了PQQ的分析能力，并提供了有关人乳和血浆样品中PQQ浓度的初步定量信息。随后，我们探讨了人乳中PQQ水平与血浆PQQ浓度以及同一受试者测量的常规生化和血液学参数之间的关系。这些发现为人们提供了关于人乳中PQQ浓度的初步定量信息，尽管相关数据仍较为有限。
章节摘录
材料与试剂
十水合四硼酸钠（分析级，98%）和盐酸（分析级，37%）购自Nacalai Tesque（日本京都）。乙腈（HPLC级，99%）、甲醇（HPLC级，99%）和硝酸（分析级，98%）购自Kanto Chemical Co.（日本东京）。丙酮（分析级，98%）和磷酸（分析级，95%）购自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.（日本大阪）。PQQ二钠盐（纯度：98%）由...
荧光衍生化
PQQ通过与丙酮反应转化为5-乙酰基-PQQ（图1A），并已有基于此反应的HPLC-UV检测方法[32]。在本研究中，我们观察到5-乙酰基-PQQ在355?nm的激发波长和460?nm的发射波长下发出强荧光，而PQQ本身仅发出弱荧光（图1B）。在分析波长下，荧光强度从0.97?×?106增加到4.1?×?106
结论
在本研究中，我们开发了一种新型的高灵敏度HPLC方法，通过简单的预柱丙酮衍生化技术实现人乳和血浆中PQQ的定量检测。该方法具有亚纳米摩尔级的检测限、高回收率和良好的重现性，同时避免了复杂性和成本。
将该方法应用于健康哺乳期女性的样本后，发现人乳中PQQ的含量存在显著的个体差异
关于语言润色中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者仅使用OpenAI的ChatGPT辅助语言改进和可读性。使用该工具后，作者对文本进行了严格审查和编辑，并对出版物的内容负全责。没有使用任何生成式AI或AI辅助工具来生成或修改科学数据、结果、图表或最终摘要。最终图表中的母亲与婴儿的插图和婴儿图标...
CRediT作者贡献声明
Naoya Kishikawa：撰写——初稿、验证、监督、资源协调、方法设计、研究实施、资金获取、数据管理。Mahmoud H. El-Maghrabey：撰写——审阅与编辑、可视化处理、验证、监督、方法设计、研究实施、数据管理、概念化。Sumire Yokoyama：撰写——审阅与编辑、验证、方法设计、研究实施、数据管理。Narumi Ushijima：撰写——审阅与编辑、方法设计
致谢
本研究使用了作为MEXT项目一部分共享的研究设备，旨在促进先进研究基础设施的公众使用（项目编号JPMXS0422500320，用于支持新的共享系统的引入）。我们还要感谢长崎大学生物医学科学研究生院的Yasufumi Fuchi博士在NMR和MS测量方面的协助。
Naoya Kishikawa|Mahmoud H. El-Maghrabey|Sumire Yokoyama|Narumi Ushijima|Kazuto Ikemoto|Naotaka Kuroda
