Internal FLAG-M1抗体（IFM1）技术：一种亚细胞区室特异性结合蛋白分离新方法及其用于Endonuclease G线粒体相互作用网络解析

《Molecular & Cellular Proteomics》：Identification of Endonuclease G binding protein using a method which specifically isolates binding partners within subcellular compartments

　　

蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络的阐明对于理解蛋白质的调控机制和功能作用至关重要。一种常用技术是表达表位标签蛋白（epitope-tagged protein，诱饵/bait），并用标签抗体进行共免疫沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP），以鉴定与标签蛋白结合的蛋白质。然而，当通常靶向特定细胞器（如线粒体或内质网（endoplasmic reticulum, ER））的诱饵蛋白被外源表达时，一部分这些蛋白质可能无法正确定位，反而积聚在胞质溶胶（cytosol）或其他非靶向区域。这种错误定位导致免疫沉淀期间的污染，因为与诱饵结合的胞质蛋白质被共沉淀。因此，迫切需要一种能够精确指认细胞器特异性结合伙伴的方法。进入线粒体或内质网等细胞器的蛋白质通常具有N端细胞器靶向序列，该序列在进入时被切除。在本研究中，研究人员描述了内部FLAG-M1抗体（internal FLAG-M1 antibody, IFM1）技术，这是一种通过抗FLAG M1抗体（anti-FLAG M1 antibody）鉴定结合伙伴的新方法，该抗体特异性识别靶向序列在细胞器内被切除后暴露的内部FLAG标签。使用内部FLAG-M1抗体（IFM1）技术，研究人员鉴定了线粒体内Endonuclease G（ENDOG）和TRX2（thioredoxin 2）的结合伙伴，并发现了与Peroxiredoxin 3（PRDX3）以及ATP合酶（ATP synthase）亚基α和β的新相互作用。总之，IFM1是一种可靠的鉴定线粒体特异性结合伙伴的方法，并已被证明是一种简便且有效的蛋白质组学工具。

该研究由Hyeog Kang、Eun Bae Kim、Alexandra L. Brown、Heeeun Yoon、Geunhye Hong和Jeonghan Kim完成。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）发生在细胞内不同空间和区室背景中，几乎参与所有细胞功能，并因其亚细胞定位而不同。已有多种体外、体内和计算机方法用于解析PPI网络，包括亲和纯化、噬菌体展示、酵母双杂交、计算机双杂交等，但各有耗时、成本、仪器可及性和高假阳性率等局限。常用策略是外源表达标签诱饵蛋白，用标签抗体免疫沉淀后质谱鉴定结合伙伴。然而，当诱饵通常靶向线粒体或内质网（endoplasmic reticulum, ER）等细胞器时，外源过表达可超过内源水平，饱和细胞器输入机器，部分蛋白留在胞质溶胶，导致免疫沉淀被胞质结合伙伴污染。细胞器分离虽可减轻污染，但技术难度高、易交叉污染，且长时间操作可能改变PPI。FLAG序列（DYKDDDDK）常用作免疫原性融合标签。抗FLAG M1（M1）抗体仅以钙依赖方式识别N端无甲硫氨酸的FLAG标签；抗FLAG M2（M2）抗体可识别N端甲硫氨酸连接、内部或C端FLAG。线粒体蛋白通常含N端线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequence, MTS），进入后被线粒体加工肽酶（Mitochondrial Processing Peptidase, MPP）切割；ER蛋白信号肽可被信号肽肽酶（signal peptide peptidase, SPP）切割。因此，研究人员提出IFM1技术：将FLAG置于靶向序列之后，只有进入细胞器并切除信号肽后才暴露内部FLAG，从而被M1识别并分离细胞器内结合伙伴。

关键技术方法：研究人员在已知MTS或ER信号肽后加入FLAG标签，构建内部FLAG标签表达载体，并在Hela、HCT116及Endog野生型（WT）/敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中表达。采用抗FLAG M1与M2抗体共免疫沉淀比较，结合共聚焦显微镜和MitoTracker Deep Red验证亚细胞定位。纯化时先用digitonin裂解去除胞质，再以Ni-NTA树脂和抗FLAG M1琼脂糖串联亲和纯化，液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）在Orbitrap Lumos数据依赖采集模式下鉴定蛋白，Sequest搜索SwissProt Human数据库。功能实验包括免疫共沉淀、非还原/还原SDS-PAGE、体外核酸酶活性、MitoSOX检测线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）、ATP含量和ATP合酶活性测定、小干扰RNA（siRNA）与实时PCR、慢病毒回补Endog KO MEF。样本来源为Hela、HCT116细胞系和Endog WT/KO MEF，无临床队列。

Verification of the technique for Mitochondrial Localized Proteins：研究人员将FLAG插入ENDOG、TRX2、PRDX5已知MTS后。M1仅识别并免疫沉淀MTS切割的成熟ENDOG，M2识别切割和未切割形式。免疫荧光显示M1标记ENDOG与MitoTracker Deep Red在超过93%线粒体共定位，而V5标记仅63%共定位且胞质明显。TRX2和PRDX5也显示M1仅识别成熟形式。结论是IFM1可选择性检测线粒体定位的成熟蛋白。

Expanding the IFM1 Strategy to Endoplasmic Reticulum Proteins：研究人员构建内部FLAG标记PDIA3，在Hela和HCT116表达。M1仅识别SPP切割的PDIA3，M2识别切割和未切割形式。免疫荧光显示M1只检测ER定位PDIA3，V5检测ER和胞质。结论是IFM1可用于ER蛋白的器官特异性下拉。

Characterization of Protein Complexes in Mitochondria under Oxidative Stress：Hela转染内部FLAG ENDOG或TRX2，48小时后以100 μM H₂O₂处理1小时，去除胞质，M1免疫沉淀，LC-MS鉴定。TRX2使用主导负性活性位点陷阱突变体C93S，并用8 M尿素去除非共价结合蛋白。研究发现ENDOG和TRX2结合PRDX3以及ATP合酶F₁部分α和β亚基；氧化条件增加这些相互作用。反向免疫共沉淀内部FLAG PRDX3确认其结合ENDOG和ATP合酶α、β。未检测到TRX2与ENDOG直接作用，提示PRDX3与ENDOG和TRX2形成互斥相互作用。

Functional Analysis of ENDOG in Regulating ROS Levels in Mitochondria：基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示ENDOG结合多种催化活性相关蛋白。MTS缺失的C端V5/His标记人ENDOG（hENDOG）在Hela中表达后，非还原/还原SDS-PAGE显示氧化诱导二聚/多聚，N-乙酰半胱氨酸（NAC）使其仅呈单体，表明分子间二硫键形成。纯化hENDOG氧化后对双链DNA核酸酶活性显著降低。氧化ENDOG活性仅在加入纯化PRDX3后恢复，提示PRDX3是主要氧化还原酶。Endog KO MEF的ROS高于WT；用慢病毒在KO MEF中回补WT或H141A活性失活突变ENDOG，二者ROS无差异，表明降低ROS依赖ENDOG蛋白结构本身而非核酸酶活性。

Investigating the Role of Oxidoreductases in Modulating ATP Synthase Stability Under Oxidative Stress：H₂O₂剂量依赖处理使ATP合酶β亚基水平降低而α不变；WT PRDX3可防止β丢失至200 μM；CS PRDX3（C239S）导致β降低，与H₂O₂无关，α无变化。PRDX3敲低降低β蛋白但不降低其转录。CS PRDX3或CS TRX2表达降低ATP合酶活性，并伴随细胞内ATP含量降低。结论是TRX2、ENDOG和PRDX3与ATP合酶亚基互作，参与氧化应激下ATP合成调节。

讨论部分指出，IFM1可用于探测线粒体PPI网络。TRX2因已知线粒体氧化还原作用被选为诱饵；ENDOG因敲除增加啮齿动物心脏ROS且敲低诱导心肌细胞生长和ROS产生，但机制不清。研究显示ENDOG蛋白存在对降低ROS不可或缺，独立于其活性，提示其与假定ROS产生器的物理互作可能是机制。LC-MS意外发现ENDOG结合支链α-酮酸脱氢酶复合体（BCKDC）的lipoamide acyltransferase component（DBT）、丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶（DLAT）以及二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）。DLD同源二聚体是PDC、α-酮戊二酸和BCKDC的E3组分，既是ROS靶点也可能参与线粒体氧化应激产生。虽无证据表明ENDOG调控DLD活性，但活性失活ENDOG仍防ROS，提示moonlighting功能可能通过调节DLD活性参与。ENDOG与ATP合酶α、β结合在氧化下增加；鉴于ATP合酶α上调可恢复活性并下调ROS，不能排除该结合是调控ATP合酶活性和ROS产生的机制，需进一步研究。线粒体功能障碍降低ATP；糖尿病心脏ROS和氧化应激增加，ATP合酶α S-谷胱甘肽化降低活性，β异常磷酸化也降低活性。PRDX3显著影响β稳定性，TRX2不影响β蛋白水平，提示TRX2可能独立调节功能。虽然CS PRDX3导致β降低的机制超出范围，但这是首次将ATP合酶β水平调控与氧化应激联系；可能通过线粒体基质LON蛋白酶。需进一步研究PRDX3不同氧化还原状态如何影响β稳定性。

研究结论部分翻译：总之，研究人员已证明IFM1是一种有用的细胞生物学技术，用于研究不同细胞区室中的蛋白质-蛋白质相互作用。它将补充酵母双杂交试验或简单共免疫沉淀等现有技术，但提供额外的细胞区室特异性。研究人员预期IFM1将成为相互作用组时代有价值的工具，既使用简便又经济可及。