尺寸排阻色谱-超滤（SEC-UF）联合CD90定向免疫捕获用于关节炎滑液中基质相关细胞外囊泡亚群的富集及蛋白质组学分析

《Journal of Extracellular Vesicles》：Enrichment and Proteomic Profiling of Stromal-Associated Extracellular Vesicle Subpopulations From Arthritic Synovial Fluid by Size-Exclusion Chromatography Coupled to CD90-Directed Immunocapture

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）正逐渐成为疾病相关细胞间通讯的关键介质，并作为包括类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）和骨关节炎（osteoarthritis, OA）等关节疾病在内的多种疾病状态中有前景的生物标志物来源。滑膜组织分子谱分析已揭示疾病驱动性细胞状态，但组织活检具有侵入性且非常规可用。滑液（synovial fluid, SF）中的EV可能为了解关节病理生物学提供微创且互补的窗口。然而，滑液的分子复杂性及EV群体的异质性阻碍了对明确的疾病相关EV亚群进行分析。为应对这一挑战，研究人员开发了一种改进的尺寸排阻色谱-超滤（size-exclusion chromatography-ultrafiltration, SEC-UF）工作流程，并将其与基于磁珠的免疫捕获（immunocapture）联用，以从关节炎滑液中有针对性地富集细胞类型相关EV亚群。作为概念验证，研究人员利用CD90/THY1靶向基质相关EV群体，该标志物是由与关节炎病理生物学相关的离散滑膜成纤维细胞亚群表达的表面标志物。使用滑膜成纤维细胞来源EV进行的体外验证确认了CD90的表面可及性，并证明可选择性免疫捕获确定的EV亚群。将该流程应用于患者来源滑液显示，SEC-UF预富集提高了从这一复杂生物流体中回收CD90⁺ EV的稳健性。液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析在滑液来源EV（SF-EV）制备物中建立了广泛的EV相关蛋白质组覆盖，并鉴定出多种反映炎症性关节炎滑膜环境的蛋白质。分馏分辨蛋白质组学使CD90免疫捕获的SF-EV亚群与未捕获的CD90^?/CD90^low SF-EV池得以比较。差异蛋白质组学与基于表面蛋白组的细胞来源分析支持CD90⁺组分中基质相关表面标志物的富集，而未捕获的SF-EV池保留了更广泛的免疫相关和残余基质EV输入。总之，该契合用途的工作流程提供了一种解析患者滑液中EV异质性的策略，并支持未来针对关节炎中确定EV亚群的生物标志物导向研究。

论文解读

研究背景与意义：EVs被认为是疾病相关细胞间通讯的重要介质和生物标志物来源。滑膜组织单细胞组学已揭示与关节炎病理相关的基质、髓系和淋巴样细胞状态，但获取滑膜组织依赖侵入性活检，难以常规用于临床。滑液与炎症滑膜直接接触，携带组织驻留细胞和浸润免疫细胞释放的EVs，可能成为微创液体活检窗口。然而，滑液是蛋白丰富、含大量细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分、血浆来源蛋白且黏度可变的复杂生物流体，其中EV群体高度异质，批量分离容易掩盖低丰度疾病相关EV亚群，并干扰基于质谱的蛋白质组学解释。因此，研究人员旨在建立一种能从关节炎滑液中选择性富集细胞类型相关EV亚群，并进行分子表征的工作流程。该研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

研究人员开展的工作与结论：研究人员将SEC-UF与纳米磁珠CD90定向免疫捕获联用，以CD90/THY1为概念验证靶标，富集基质相关EV亚群，并以Western blot、LC-MS/MS蛋白质组学和基于表面蛋白组的细胞来源分析评估CD90⁺ EV富集及其与非捕获SF-EV池的分离。研究结论为：SEC-UF预富集可改善从复杂滑液中回收CD90⁺ EV的稳健性；该流程可获得广泛EV相关蛋白质组覆盖；CD90免疫捕获组分与非捕获CD90^?/CD90^low组分具有分子差异；表面蛋白组细胞来源分析支持CD90⁺组分富集基质相关标志物，而非捕获组分保留更广泛免疫相关及残余基质EV输入。其意义在于为解析关节炎滑液EV异质性提供方法学和分析学框架，支持未来针对确定EV亚群的液体活检生物标志物研究。

为开展研究，作者采用的主要关键技术方法如下：样本来自瑞士巴塞尔大学医院风湿科患者的炎症性和退变性关节炎滑液，包括RA、OA或晶体性关节病；预筛选13例，蛋白质组分析11例；滑膜组织来自骨科和风湿科RA/OA患者；健康供体外周血用于单核细胞来源M1样巨噬细胞。核心技术包括SEC-UF富集EV、纳米磁珠抗CD90/抗PDPN免疫捕获、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）、纳米流式细胞术（nano flow cytometry, nFCM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、Western blot、DIA LC-MS/MS蛋白质组学、SurfaceGenie细胞表面蛋白共识（cell surface protein consensus, SPC）评分以及公共单细胞表达图谱映射。

研究结果：3.1 探索性预筛选在关节炎患者滑液EV中检测到基质和髓系相关标志物。通过超速离心（ultracentrifugation, UC）批量分离13例患者SF-EV，并以Western blot检测CD90、PDPN、CD68、CD48、CD163、syntenin-1和人血清白蛋白，发现PDPN普遍检测到，CD163较稳定，CD90、CD68和CD48存在明显供者间差异；技术重复显示分离流程较一致，syntenin-1用于归一化后CD90变异最明显。结论是批量SF-EV中存在基质和髓系标志物，但异质性支持开发选择性EV亚群富集策略。

3.2 滑膜成纤维细胞来源EV中CD90/PDPN表面可及性与选择性EV免疫捕获的体外验证。研究人员培养关节炎患者滑膜成纤维细胞，以其条件培养基经SEC-UF分离EV，TEM和NTA显示小EV形态及30–130 nm粒径、1–2×10¹⁰ particles/mL浓度；nFCM在非固定非透化条件下显示CD90和PDPN表面可及；膜蛋白分级和Western blot证实其膜定位。使用50 nm抗CD90或抗PDPN磁珠免疫捕获后，洗脱液（E）富集CD90⁺和PDPN⁺ EV，流穿液（FT）保留CD63、flotillin-1等；同型对照无捕获。混合EV和滑液加标实验进一步表明CD90定向免疫捕获可选择性回收CD90⁺ EV，且在滑液背景中仍可检测，尽管效率降低。

3.3 SEC-UF预富集支持从关节炎滑液中CD90和PDPN定向免疫捕获EV亚群。对患者滑液进行预处理并经SEC-UF富集后，TEM显示完整EV并减少背景。对3例患者SF-EV进行抗CD90或抗PDPN免疫捕获，E组分成功回收CD90⁺ EV，包括批量EV中CD90不可检的患者；E共富集PDPN和annexin-1，而CD68、CD48、CD163未检出；FT富集髓系标志物及一种PDPN亚型。直接对预处理滑液进行免疫捕获结果变异较大，白蛋白共富集更明显，说明SEC-UF预富集提高靶向EV回收稳健性。

3.4 LC-MS/MS谱分析建立关节炎SF-EV广泛EV相关蛋白质组覆盖及生物学背景。对11例患者SEC-UF富集SF-EV进行DIA LC-MS/MS，鉴定3306个蛋白；其中2961个与ExoCarta小EV蛋白重叠，405个与551个高丰度血浆蛋白重叠，246个未在ExoCarta报道，200个未在既往MS检测SF-EV数据中报道。Human Protein Atlas（HPA）分类显示胞内蛋白1966个、膜相关蛋白818个、分泌蛋白514个。功能上包括经典EV蛋白、ESCRT、SNARE、Ras GTPase、annexin、flotillin、septin、tetraspanin、SLC、14-3-3和RNA结合蛋白等，并反映炎症滑液的血浆渗出、补体、凝血、急性期蛋白和ECM重塑背景。结论是SEC-UF SF-EV提供广泛EV相关蛋白质组覆盖，并保留关节炎滑液生物学背景。

3.5 分馏分辨差异蛋白质组学区分CD90免疫捕获与非捕获SF-EV群体。对11例患者配对E和FT进行蛋白质组分析，PCA显示E与FT形成不同聚类；差异分析发现616个蛋白显著不同（校正p值<0.05），其中269个富集于CD90⁺ EV组分，296个富集于FT组分，51个显著但未达|log₂FC|≥1.5阈值；CD90在E中富集，确认靶向回收。结论是SEC-UF联用CD90免疫捕获可将患者滑液异质EV池分离为蛋白质组学不同的EV群体。

3.6 基于表面蛋白组的细胞来源分析解析洗脱液与流穿液中基质相关与更广泛免疫相关EV输入。限制于SPC评分4–3–2的表面可及膜蛋白后，E富集FAP、PDGFRB、EGFR等基质相关标志物，而FT富集CXCR4、CD8A、CD48、MARCO等免疫相关标志物；384个CD标志物中150个被检测。将显著富集表面蛋白与10类细胞类型特征（cell type signatures, CTS）比较，E偏向成纤维细胞、肌肉细胞、间充质/基质和内皮相关信号，FT偏向髓系和淋巴样信号。与已发表滑膜成纤维细胞和炎症滑膜单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据及Broad Institute Single Cell Portal和Tabula Sapiens映射后，E主要呈成纤维/基质表达模式，FT呈混合髓系/淋巴样伴残余基质模式。结论是CD90定向免疫捕获富集基质相关EV组分，而非捕获池保留更广泛免疫相关及残余基质EV输入。

讨论与结论总结：讨论部分指出，滑液EV生物标志物开发受源材料复杂性、患者异质性、高丰度血浆蛋白和ECM成分干扰等限制。SEC-UF预富集可降低基质复杂性并改善CD90定向EV回收，直接免疫捕获滑液则较不稳定。蛋白质组学显示3306个蛋白，扩展了SF-EV覆盖，并鉴定出与炎症、免疫调节、基质重塑和慢性关节病理相关的候选蛋白。E/FT分离模式与滑膜中CD90⁺和CD90^?成纤维细胞状态相符，但CD90免疫捕获不应被理解为回收全部基质EV，FT也不是纯非基质组分。研究限制包括队列有限且关节炎类型异质、未纳入健康滑液对照、未与未分级滑液蛋白质组直接比较，以及蛋白质组学不能完全区分真正EV囊泡货物/表面蛋白与共分离生物流体成分。研究结论翻译：总之，本研究确立SEC-UF联用CD90定向免疫捕获作为一种改进的工作流程策略，用于从复杂关节炎滑液中富集基质相关EV亚群。该方法将适应基质的EV预富集与标志物导向的亚群回收相结合，并提供足够的蛋白质组深度，以评估批量SF-EV制备物以及捕获与未捕获EV亚群之间的分馏分辨差异。差异蛋白质组学和基于表面蛋白组的细胞来源分析支持该方法的技术有效性和生物学背景。总体而言，所呈现的发现为解析关节炎生物流体中EV异质性提供了方法学和分析学途径。未来需在更大且临床分层的队列中研究，以确定CD90⁺ EV或其他确定EV亚群能否支持关节炎液体生物标志物发现。