《Neuroscience Letters》：Analysis of the participation and influence of the cerebellum in emotion and emotional memory processing in mice through c-Fos expression
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摘要：小脑在非运动功能（如情绪和认知过程）中的参与日益受到关注。小脑的功能地形学仍无定论，临床和临床前研究均致力于识别其功能分区，以期更好地理解小脑神经生理学及其在不同功能中对其他脑结构的影响。本研究旨在分析抑制性回避（IA）任务在不同情境和时间条件下小脑小叶
摘要：小脑在非运动功能（如情绪和认知过程）中的参与日益受到关注。小脑的功能地形学仍无定论，临床和临床前研究均致力于识别其功能分区，以期更好地理解小脑神经生理学及其在不同功能中对其他脑结构的影响。本研究旨在分析抑制性回避（IA）任务在不同情境和时间条件下小脑小叶IV-V、VI和VII的激活情况，并评估这些小叶与其他参与情绪和记忆加工的脑区之间c-Fos表达的相关性。研究人员将33只 na?ve Swiss Albino 小鼠暴露于IA箱中1天、4天和8天。各组动物最后一次暴露于评估装置后90分钟实施安乐死，随后进行经心脏灌注和取脑。对预先设定的结构进行c-Fos免疫荧光分析。结果显示，执行IA任务4天的动物在小脑小叶IV-V和VI中观察到显著的c-Fos/DAPI比值。在其他感兴趣区域未发现c-Fos表达的显著差异。斯皮尔曼相关系数检验未显示各感兴趣区域间c-Fos/DAPI比值的相关性。这些结果表明，小脑小叶IV-V和VI可能在IA任务中被差异性募集，但其在情绪和情绪记忆加工中的具体作用仍有待确定。
论文解读：小脑小叶IV-V与VI在小鼠抑制性回避任务中参与情绪与情绪记忆加工——基于c-Fos表达的神经激活分析
研究背景与研究目的
长期以来，小脑被视为纯粹的运动协调中枢。然而，近年来大量临床与基础研究表明，小脑在非运动功能，尤其是情绪加工和认知过程中扮演着重要角色。人类影像学研究显示，小脑小叶V、VI、VIIIa、Crus I和Crus II在对快乐、愤怒、恐惧等情绪图像进行分类时被激活；小脑损伤患者常伴有显著的认知和情绪障碍。解剖学和功能连接研究进一步证实，小脑与杏仁核、海马、内侧前额叶皮层（mPFC）等情绪加工关键脑区之间存在双向纤维联系。例如，小脑蚓部和杏仁核的失活会损害恐惧记忆的提取，而基底外侧杏仁核对小脑浦肯野细胞的平行纤维长时程增强具有调节作用。此外，动态因果模型表明，在增强情绪记忆编码期间，小脑与海马之间的有效连接强度增加。然而，小脑内部各小叶在情绪和情绪记忆加工中的具体功能分工及其与下游情绪脑区的因果关系尚不明确。为此，研究人员设计了本研究，旨在通过检测即刻早期基因c-Fos的表达，分析不同暴露时长（1天、4天、8天）和不同条件（抑制性回避任务IA组、单纯电击Shock组、空白对照组）下，小鼠小脑小叶IV-V、VI和VII的神经元激活模式，并探索这些小叶与杏仁核、海马各区及mPFC亚区之间的激活关联，从而推断小脑在情绪和情绪记忆加工中的作用。
研究方法概述
研究人员使用了33只雄性 na?ve Swiss Albino 小鼠，分为抑制性回避组（IA）、单纯电击组（Shock）和空白对照组（Cn）。IA组动物经历标准的抑制性回避任务：第一天进行获得相（acquisition phase）和巩固相（consolidation phase），之后每天一次提取相（retrieval phase），分别持续1天、4天或8天。Shock组动物直接被放入暗室接受足部电击，同样按1、4、8天分组。最后一次暴露后90分钟，动物被深度麻醉并经心脏灌注固定，取脑制备40 μm冠状切片。采用免疫荧光技术标记c-Fos蛋白，并使用DAPI复染细胞核。通过自动显微镜采集图像，利用ImageJ软件计数c-Fos阳性细胞数和DAPI染色细胞数，计算c-Fos/DAPI比值作为神经元激活的相对指标。统计分析方法包括Kruskal-Wallis检验、单因素方差分析（ANOVA）以及基于对齐秩变换（ART）的析因分析，用于比较组间和组内差异；同时采用斯皮尔曼相关系数评估各感兴趣区域c-Fos/DAPI比值之间以及与行为表现的相关性。
研究结果
3.1 动物在IA任务中的潜伏期
行为数据显示，IA组动物在后续暴露中进入暗室的潜伏期显著延长。IA-4天组在第4天的潜伏期显著高于IA-1天组；IA-8天组在第8天的潜伏期显著高于IA-1天组和自身第1天。所有IA-8天组动物在第8天均未进入暗室，未再接受电击。这表明重复暴露增强了任务相关的记忆。
3.2.1 小脑c-Fos表达
小脑小叶IV-V：Kruskal-Wallis检验显示各组间c-Fos/DAPI比值存在显著差异。Dunn事后检验表明，IA-4天组的c-Fos表达显著高于空白对照组（Cn）。ART析因分析进一步揭示显著的组别×时间交互作用，IA-4天组的比值显著高于IA-1天组和Shock-4天组。
小脑小叶VI：同样存在显著组间差异。IA-4天组的c-Fos表达显著高于Shock-4天组。剔除异常值后的敏感性分析仍维持这一差异。ART分析也确认了显著的组别×时间交互作用，IA-4天组显著高于Shock-4天组。
小脑小叶VII：未发现统计学显著差异。ART分析仅显示组别主效应显著，IA组整体高于Shock组，但时间和交互作用不显著。
3.2.2 基底外侧杏仁核：未发现任何组间显著差异。
3.2.3 海马：齿状回、CA1和CA3区均未见总体组间差异。ART分析显示CA1区存在显著的组别主效应（IA组高于Shock组）和时间主效应（第8天低于第1天和第4天），但交互作用不显著。CA3区仅时间主效应显著（第4天高于第8天）。
3.2.4 内侧前额叶皮层：前扣带皮层（ACC）、前边缘皮层（PrL）和下边缘皮层（IL）均未见显著组间差异。ART分析仅显示ACC区存在组别主效应（IA组高于Shock组）。
3.2.5 斯皮尔曼相关分析：在IA-4天组中，各感兴趣区域的c-Fos/DAPI比值之间未发现显著相关性。此外，小脑小叶IV-V和VI的c-Fos/DAPI比值与IA任务潜伏期之间也未发现显著相关。
讨论与结论
本研究发现，在抑制性回避任务中暴露4天的小鼠，其小脑小叶IV-V和VI表现出显著升高的c-Fos表达，且这种激活模式在IA组中强于单纯电击组，提示这些小叶可能被特异性募集于包含学习、记忆和情绪成分的任务情境中。4天的时间窗口可能代表记忆存储的一个敏感期，此时小脑的神经元激活达到高峰；而8天后c-Fos表达下降可能与行为天花板效应及神经元习惯化有关。尽管行为上动物表现出明确的恐惧记忆，但在杏仁核、海马和mPFC等经典情绪脑区并未检测到显著的c-Fos变化，这可能归因于c-Fos时间窗的限制、样本量较小以及个体间高变异性。斯皮尔曼相关分析未发现小脑与这些脑区之间的激活关联，提示小脑可能并非通过简单的线性协同方式发挥作用，而是以一种更为动态的调制机制影响下游情绪回路。
结论部分指出：小脑可能参与情绪加工。c-Fos提供的是神经元激活的间接测量，因此不能基于本研究结果对小脑在情绪和情绪记忆加工中的参与做出绝对的断言。然而，在小脑小叶IV-V和VI中观察到的c-Fos表达升高提示，在特定的时间窗口内，小脑确实参与了情绪和情绪记忆的加工。其对其他参与情绪加工的脑结构的影响尚未完全阐明。尽管本研究未显示各感兴趣区域间c-Fos/DAPI比值的相关性，但已有研究表明小脑可能影响其他脑结构的活动。未来研究应进一步探讨小脑对参与情绪加工的脑结构的调制作用假说，特别是在需要记忆、预测和决策等相关认知过程的条件下。
