缺血性脑卒中神经元铁死亡的内源性保护机制：神经元CCR5通过AMPK/ACC信号通路维持GPX4抗氧化防御

《Neurotherapeutics》：CCR5 protects against permanent brain ischemia by suppressing neuronal ferroptosis through AMPK/ACC signaling

　　

缺血性脑卒中（Ischemic stroke）可触发毁灭性的神经元损伤级联反应，铁死亡（ferroptosis）是缺血后神经元丢失的关键介质。尽管C–C趋化因子受体5型（CCR5）传统上被认为参与卒中后神经炎症，但其在神经元铁死亡中的细胞特异性作用仍不清楚。本研究结合单细胞转录组分析、永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）小鼠模型以及体外缺氧-缺血模拟条件，明确了神经元CCR5的内源性神经保护作用。单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了CCL-CCR信号通路的显著上调，其中CCR5被确定为介导细胞间相互作用的关键枢纽。在体内实验中，pMCAO后48小时至一个月，CCR5在梗死周围神经元中显著升高，而非小胶质细胞或星形胶质细胞，提示这是一种内在应激反应。在体外实验中，SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元在缺氧-缺血模拟条件下重现了这种代偿性但不足的CCR5诱导，同时伴随缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）上调、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）耗竭及严重脂质过氧化。功能研究表明，CCR5敲低或使用马拉韦罗（MVC）进行药理学抑制可进一步加重GPX4减少和脂质过氧化物积累，而CCR5过表达则可显著恢复抗铁死亡能力。CCR5正向调控AMP活化蛋白激酶（AMPK）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化，抑制AMPK可完全消除CCR5介导的GPX4维持和抗铁死亡防御。在体内实验中，MVC给药进一步加速梗死周围铁沉积、减少神经元存活，并显著恶化pMCAO小鼠的长期运动缺陷。综上所述，这些发现揭示了一种此前未被识别的内源性适应机制，即缺血诱导的神经元CCR5通过AMPK/ACC介导的GPX4维持来限制铁死亡，为缺血性脑卒中强化内源性保护信号提供了新的治疗概念。

缺血性脑卒中（Ischemic stroke）是导致全球长期残疾和死亡的主要原因之一。尽管再灌注治疗（包括静脉溶栓和机械取栓）显著改善了部分患者的临床预后，但仍有大量患者因再灌注不完全及继发性损伤级联反应而出现进行性神经功能障碍。越来越多的证据表明，缺血性卒中后的神经元死亡不仅源于急性能量剥夺，还涉及氧化应激、炎症反应、代谢功能障碍及多种形式的调节性细胞死亡等复杂病理过程。其中，铁死亡（ferroptosis）作为一种以铁依赖性氧化损伤和脂质过氧化物过度积累为特征的调节性细胞死亡形式，已被证实是缺血性脑损伤的重要贡献者。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）作为解毒脂质过氧化物的关键抗氧化酶，是铁死亡的核心抑制因子。然而，缺血损伤后维持神经元抗铁死亡能力的内源性适应机制仍不完全清楚。近年来，单细胞转录组技术的进展揭示了缺血性卒中后细胞组成和细胞间通讯网络的广泛重塑，趋化因子信号通路在损伤后炎症和组织反应中的作用日益受到关注。C–C趋化因子受体5型（CCR5）作为一种传统上与免疫调节和炎症细胞募集相关的G蛋白偶联受体，已被涉及卒中病理生理过程。研究人员前期工作已证明，脑源性而非骨髓源性CCR5在缺血性卒中亚急性期发挥关键神经保护作用。基于这些研究，研究人员假设缺血后神经元CCR5的早期上调代表一种内源性的、细胞自主的适应性应激反应，用于对抗急性缺血应激。本研究结合单细胞转录组分析、体内外实验方法，系统研究了缺血损伤后神经元CCR5的生物学作用，发现缺血应激诱导神经元CCR5的代偿性上调，进而激活AMPK/ACC信号通路并部分维持GPX4介导的抗氧化防御，最终限制缺血诱导的铁死亡和神经元损伤。

研究人员首先利用公开可获取的tMCAO小鼠单细胞RNA测序数据集（GEO数据库，登录号GSE174574），通过Seurat包进行细胞聚类和注释，鉴定出17个转录组学上不同的细胞簇，涵盖神经元、内皮细胞亚群、小胶质细胞、活化小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞、平滑肌细胞、边界相关巨噬细胞、脉络丛细胞、骨髓来源单核细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和室管膜细胞等主要细胞类型。采用CellChat框架进行配体-受体相互作用分析，比较sham和tMCAO组间的细胞间通讯变化。在动物实验中，使用约3月龄雄性C57BL/6小鼠建立永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型，通过电凝法永久闭塞右侧大脑中动脉。治疗研究中共纳入28只小鼠，分为Sham组（n=7）、pMCAO+PBS组（n=11）和pMCAO+MVC组（n=10），MVC以25 mg/kg腹腔注射，于术前一天开始给药并连续三天。行为学评估包括足失误测试和圆筒测试，分别于术后第17天和第18天进行。组织学分析采用免疫荧光染色检测CCR5的时空表达及细胞定位，普鲁士蓝染色评估铁沉积，尼氏染色测定梗死体积。体外实验中，SH-SY5Y细胞和胚胎第18天（E18）小鼠原代皮层神经元采用氯化钴（CoCl₂）联合低糖培养基建立化学缺氧-缺血模拟条件（cOGD）模型。功能研究采用CCR5 shRNA敲低、CCR5过表达质粒转染以及MVC药理学阻断，结合AMPK抑制剂Compound C（COC）验证信号通路机制。生化检测包括MDA水平测定（硫代巴比妥酸法）和NADP⁺/NADPH比值测定，蛋白表达通过Western blot分析。

单细胞转录组学鉴定脑缺血后细胞间通讯的深刻变化：对整合的scRNA-seq数据集进行t-SNE分析，共鉴定出17个转录组学上不同的细胞簇。与sham组相比，tMCAO后推断的细胞间相互作用总数从1326增加到1618，而整体相互作用强度从41.162降至33.773。缺血损伤触发多种细胞类型（包括骨髓来源单核细胞、活化小胶质细胞、中性粒细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和神经元）的传入/传出信号显著重塑。信号通路分析显示，TGFβ、GRN、ncWNT、COMPLEMENT、FASLG及传统生长因子信号（GAS、IGF、VEGF、FGF）在sham组中占主导，而巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、CCL和肿瘤坏死因子（TNF）等炎症通路在tMCAO后显著增强。在CCL信号通路中，Ccl4–Ccr5、Ccl3–Ccr1和Ccl6–Ccr1被鉴定为tMCAO小鼠中的主要信号对，其中Ccl4–Ccr5轴是朝向神经元的CCL介导细胞间通讯的重要贡献者。

pMCAO后梗死周围皮层CCR5表达的时空动态和神经元定位：免疫荧光染色显示，与sham小鼠相比，pMCAO后梗死周围皮层CCR5免疫反应性显著增加。定量分析证实CCR5阳性细胞数和CCR5阳性面积百分比均显著升高，CCR5升高在pMCAO后48小时即可检测到，并持续至术后1个月。共免疫染色结合三维重建和正交切面分析表明，pMCAO后48小时CCR5主要定位于NeuN阳性神经元，而与小胶质细胞标志物Iba1或星形胶质细胞标志物GFAP的重叠信号有限，证明梗死周围神经元是急性期表达CCR5的主要细胞群。

缺血损伤诱导铁死亡反应伴随CCR5信号的代偿性激活：普鲁士蓝染色显示pMCAO后7天开始梗死周围皮层铁沉积显著增加，7至14天达到峰值，并持续升高至1个月。在SH-SY5Y细胞中，低糖条件下递增浓度的CoCl₂诱导HIF-1α表达呈剂量依赖性上调，CCR5表达在50 μM中间剂量时达到峰值，而GPX4水平在该浓度下显著降低。缺氧-缺血模拟条件显著增加MDA水平，Calcein-AM/PI染色显示细胞死亡呈剂量依赖性增加。

CCR5在缺氧-缺血模拟条件下减弱神经元铁死亡反应：CCR5 shRNA敲低进一步降低GPX4表达，显著加重MDA积累并降低NADPH/NADP⁺比值。CCR5过表达在缺氧-缺血模拟条件下部分但显著地恢复GPX4蛋白水平，显著抑制MDA积累并增加NADPH/NADP⁺比值。MVC处理不改变CCR5总蛋白表达水平，但阻断下游CCR5信号，导致GPX4表达显著进一步降低和MDA积累增加。

CCR5在缺氧-缺血模拟条件下促进AMPK/ACC信号激活：CCR5敲低显著降低AMPK和ACC的磷酸化水平而不改变总蛋白水平。CCR5过表达进一步增强缺血条件下AMPK和ACC的磷酸化。MVC处理显著削弱缺血诱导的AMPK和ACC磷酸化。这些发现表明CCR5是缺血应激神经元中AMPK/ACC信号级联的正向上游调节因子。

AMPK抑制完全消除CCR5介导的GPX4维持和抗铁死亡保护：AMPK抑制剂COC处理显著阻断缺血诱导的AMPK和ACC磷酸化激活，对CCR5表达影响甚微，但显著降低GPX4水平并进一步增加MDA积累，支持CCR5–AMPK–GPX4信号通路在缺血应激下调节神经元氧化还原稳态。

原代培养神经元中缺氧-缺血模拟条件下CCR5介导的GPX4调节：原代皮层神经元暴露于缺氧-缺血模拟条件导致GPX4蛋白表达呈剂量依赖性显著降低。MVC预处理显著加速GPX4耗竭，验证了内源性神经元CCR5信号在缺血损伤中积极参与维持GPX4依赖性抗氧化防御。

CCR5的药理学抑制加重缺血性卒中后的长期神经功能缺陷和铁死亡损伤：pMCAO小鼠接受MVC（25 mg/kg，腹腔注射）治疗后，在术后第17天和第18天的足失误测试中表现出显著更高的步进错误频率，圆筒测试中表现出明显的前肢使用不对称。MVC处理显著增加脑梗死体积、梗死周围皮层铁沉积，并进一步减少NeuN阳性存活神经元数量。

讨论与结论：本研究通过单细胞转录组分析、体内外功能实验和机制验证，揭示了缺血性脑卒中后神经元CCR5的时空动态表达模式及其在铁死亡调控中的内源性神经保护作用。研究发现，在永久性脑缺血条件下，梗死周围神经元自主启动进行性铁死亡程序，伴随CCR5的持续代偿性上调，这代表一种高度特化的细胞自主适应性应激反应。机制上，CCR5作为代谢型G蛋白偶联受体，通过正向调控AMPK/ACC信号通路，部分维持GPX4依赖性抗氧化防御，限制脂质过氧化和神经元损伤。研究同时指出，CCR5在卒中中的作用高度依赖缺血亚型和疾病阶段，在永久性脑缺血中发挥内源性保护作用，而既往基于短暂缺血-再灌注模型的研究则报道CCR5抑制在恢复期具有有益效果，这种情境依赖性效应凸显了在考虑CCR5靶向治疗策略时区分永久性缺血与再灌注损伤的必要性。从转化角度而言，大多数缺血性卒中患者因治疗时间窗狭窄而无法及时接受tPA或血栓切除术，独立于血管再通的干预措施亟需开发。由于pMCAO模型模拟持续非再灌注缺血状态，靶向神经元CCR5有望为这类患者群体开发延迟神经保护策略提供新思路。研究结论表明，缺血性脑卒中诱导神经元CCR5的动态上调，内源性CCR5激活通过促进AMPK/ACC信号传导和部分维持GPX4依赖性抗氧化防御，限制缺血性卒中后的脂质过氧化和神经元损伤，为缺血性脑卒中的神经保护治疗提供了新的概念和潜在靶点。