《Reproduction in Domestic Animals》：Livestock Blastoids: In Vitro Blastocyst Models for Embryogenesis and Reproductive Technologies
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对家畜早期胚胎发生（embryogenesis）的理解仍是生殖生物学和动物育种中的持续瓶颈。家畜物种研究长期受限于胚胎获取受限、伦理考量以及围植入期发育（peri-implantation development）的复杂性，使机制研究困难。近期干细胞生物学进展
对家畜早期胚胎发生（embryogenesis）的理解仍是生殖生物学和动物育种中的持续瓶颈。家畜物种研究长期受限于胚胎获取受限、伦理考量以及围植入期发育（peri-implantation development）的复杂性，使机制研究困难。近期干细胞生物学进展开始改变这一局面。囊胚样结构（blastoids）为体外（in vitro）模拟早期发育提供了实用方法。Blastoids 捕获自然囊胚的关键特征，包括整体结构、谱系组成和基因表达模式，同时在实验上更易获取。在家畜物种，尤其是牛和猪中，blastoid 模型开始受到关注。家畜 blastoids 提供可操作（tractable）系统，用于研究谱系特化（lineage specification）、上胚层-胚外（epiblast-extraembryonic）相互作用和早期孕体（conceptus）发育。它们也为改进辅助生殖技术（ART）打开大门，通过实现受控、可扩展实验，而单用胚胎无法做到。在本综述中，研究人员总结了家畜 blastoids 生成的最新进展，并讨论这些系统如何用于研究跨家畜物种的早期发育，并为下一代生殖技术提供信息。研究人员强调当前局限性并概述未来关键挑战，包括如何将 blastoid 模型与基因组编辑（genome editing）、干细胞工程（stem cell engineering）及相关基于胚胎（embryo-based）的方法结合，以提高家畜繁殖效率。
1 Introduction
家畜繁殖效率是畜牧生产关键性状，影响群体周转、遗传增益、成本和可持续性。辅助生殖技术（ART）如人工授精（AI）、胚胎移植（ET）、体外胚胎生产（IVP）和体细胞核移植（SCNT）等已广泛应用，基因组选择和基因编辑提高遗传改良精度。但早期胚胎丢失仍是主要限制，许多孕体（conceptus）在植入前或母体妊娠识别期失败，尤其在牛和猪。实验可及性受限：早期胚胎数量少、发育不同步、操作敏感，围植入期更不易研究，因此机制认识多来自啮齿类，但家畜在发育时序、信号需求、多能性状态、谱系分配和滋养层行为上不同。干细胞基胚胎模型可绕过部分限制。囊胚样结构（blastoids）模拟囊胚首个组织化架构，家畜进展加速：牛 EPSCs 与 TSCs 生成 blastoids，XEN 样细胞改善下胚层代表；猪化学诱导 EPSCs 或 ESCs 生成囊胚样结构；羊通过 CDX2 驱动 iCDX2-sESCs 与 sESCs 共培养，效率约80%。综述关注谱系特化、胚胎质量、发育能力和早期孕体信号，并讨论与基因编辑和干细胞工程整合。
2 Building Blocks of Livestock Blastoids
生成 blastoids 依赖重建囊胚关键谱系。哺乳动物中，滋养外胚层（TE）与内细胞团（ICM）分离，ICM 分为上胚层和下胚层（原始内胚层）；上胚层形成胚胎本体，下胚层形成胚外内胚层，TE 产生滋养层谱系。体外重建需代表各区域的干细胞并协调互作。家畜 PSCs 难衍生稳定，谱系潜能可变，反映信号需求、谱系分离时序和多能性状态差异。近年牛和猪报告扩展或中间特征 PSCs、滋养层样和胚外内胚层样细胞，为 blastoids 提供基础。
2.1 Na?ve and Primed Pluripotent Stem Cells
多能性常分为 na?ve 和 primed。Na?ve PSCs 与植入前上胚层相关，发育潜能广；primed PSCs 类似植入后上胚层，更谱系偏向。该框架主要基于小鼠和人，不完全适用于家畜。家畜稳定 na?ve-like 状态难捕获，抑制 MEK/ERK 和 GSK3 等条件诱导的特征常不完全、短暂、异质并漂向 primed-like。Primed PSCs 更一致衍生，需 FGF 和 Activin/Nodal 激活并抑制经典 WNT，支持植入后样身份，虽缺乏广潜能但更稳定，是家畜最广泛使用的多能平台。
2.2 Expanded Potential Stem Cells
EPSCs 被提议为比 na?ve 或 primed 更广发育能力的多能状态，可贡献胚胎和胚外谱系如 TE 和原始内胚层。通过调节 WNT、MAPK/ERK、细胞极性和 Hippo 信号维持，显示早期胚胎转录特征和较大发育灵活性。牛和猪 EPSC-like 系可生成胚胎和胚外细胞，用于构建 blastoids，优势在于单一起始群体可导向多谱系。但 EPSCs 生物学身份未定，胚外谱系贡献不一致且依赖实验背景，培养敏感异质。总体是实用 workaround，与体内早期胚胎等价性待严格定义。
2.3 Extraembryonic Stem Cells
胚外干细胞包括 TSCs 和 XEN 细胞，对应滋养层和下胚层。TSCs 代表胎盘上皮谱系，牛 TSC-like 系可体外扩增并分化为滋养层轨迹，但与体内 TE 等价未完全解决；猪稳定长期 TSC 系少成功。下胚层更难捕获，近期牛 XEN-like 细胞从囊胚建立，表达 SOX17 和 GATA6，可多代维持并支持与多能细胞互作，但仍早期。猪等未清晰建立 XEN-like 系，下胚层样群体多通过 PSCs 分化。总体胚外干细胞进展显著尤其牛，但不如小鼠稳健标准化，需定义发育等价性。
3 Livestock Blastoids: From Proof of Concept to Emerging Embryo Models
牛、猪、羊已报告 blastoid 系统。牛和羊多依赖组合多细胞群，包括多能或 EPSCs 与滋养层及胚外内胚层样细胞；猪多通过定向分化或自组织多能或 EPSCs。虽捕获囊胚结构和谱系分离方面，但仍早期模型，非完全功能等价胚胎。
3.1 Bovine Blastoids
牛 EPSCs 与 TSCs 在三维培养形成 blastoids，效率较高，形态类似第7–8天牛囊胚，含囊胚腔、TE 样外层和 ICM 样区室，表达 SOX2、SOX17、GATA3、KRT18、CDX2 等标记。单细胞转录组支持胚胎和胚外谱系轨迹，但谱系比例不匹配，下胚层样不足、上胚层样富集，谱系特化不完整。牛 blastoids 可延长三维培养并显示滋养层增殖，初步证据提示移植后可引发母体妊娠识别方面，但持续围植入发育和孕体伸长不清楚。添加牛 XENs 生成 EPTX blastoids 改善下胚层代表。总体超越概念验证，但保真度待提高。
3.2 Porcine Blastoids
猪 blastoids 多采用单多能或 EPSC 群体自组织，类似人 blastoids。化学诱导 EPSCs 在三维培养生成囊胚样结构，显示腔形成和胚胎/胚外样区隔，但保真度变异。猪 ESCs 在 4FIXY 培养基维持 primed 多能状态，经三维分化形成类似猪囊胚的结构，单细胞转录组沿上胚层和胚外谱系轨迹，但与体内胚胎对应不完全。猪 blastoids 可长期维持扩展，谱系特化不如多谱系组装系统严格，下胚层和滋养层区室常需定向诱导。总体强调单干细胞群体自组织的不同路线。
3.3 Ovine Blastoids
羊 blastoid 通过 CDX2 驱动 sESCs 过表达（iCDX2-sESCs）与 sESCs 在三维聚集系统共培养生成。两步诱导：小聚集体在含 FGF2、activin A 和 CHIR99021 的 HDM 中形成下胚层样细胞，后转至含多西环素 N2B27 维持 CDX2 诱导，优化条件 HDM-AM-#2 使效率约80%。结构类似自然囊胚，含上胚层、下胚层和 TE 样三个谱系，比例相似，转录组强相似。功能上可产生胚胎和胚外内胚层干细胞系并短期扩展，但长期活力较自然囊胚降低。
4 Blastoids as Platforms for Reproductive Technologies in Livestock
Blastoids 可连接发育生物学与繁殖实践。其一，优化胚胎培养条件，比较培养基、氧张力、生长因子、细胞外基质和换液时机，监测谱系分配、腔形成、上皮完整性和基因表达，但需胚胎验证。其二，功能遗传学，适合基因组编辑，在起始多能和胚外干细胞引入扰动，优先验证早期发育候选基因。其三，研究早期胚胎丢失，隔离测试谱系失衡、滋养层上皮化缺陷、胚胎-胚外互作破坏和环境应激。其四，孕体信号和胚胎-母体互作，初步证据牛 blastoid 移植后可产生母体妊娠识别相关信号，但有限。总体不替代胚胎，而是可处理互补系统。
5 Current Limitations
主要限制是保真度：形状和标记表达相似不够，需评估谱系比例、空间组织、转录和表观遗传谱、发育时序和功能输出。不同生成策略引入偏差：组装基方法依赖输入细胞质量，自组织系统谱系特化较不受控。阶段覆盖不足，多数系统未重现围植入发育全程，而孕体伸长和物种特异信号对妊娠建立重要。标准化缺乏，无广泛接受框架定义家畜 blastoid。移植后能否支持持续围植入发育包括孕体伸长仍未解决，初步研究仅提示牛 blastoids 可能瞬时诱导母体妊娠识别。
6 Future Directions: Towards Functional, Comparative and Translational Livestock Embryo Models
未来需定义可靠功能。一是改善谱系完整性和定义，更好表征各物种上胚层、滋养层和下胚层干细胞状态，更精确映射体内对应。二是比较分析，利用牛猪羊 blastoids 受控研究谱系特化、滋养层行为和多能状态跨物种差异。三是与生殖技术整合，纳入测试培养条件、基准干细胞系、优先候选基因，并评估滋养层功能和早期孕体信号。更广泛，帮助精炼胚胎质量定义，从形态/存活转向谱系平衡、结构组织和信号能力。还可扩展到山羊和马等物种。价值取决于从描述性相似转向可测量功能。
7 Conclusions
家畜 blastoids 是新兴体外模型，牛猪羊工作显示干细胞可形成囊胚样结构，捕获基本结构、谱系分离和早期培养生长。价值在用途：研究谱系特化、胚胎-胚外交互和早期孕体信号，测试培养条件、探测基因功能、探索胚胎能力和早期妊娠丢失机制。但系统不完整，不完全匹配胚胎谱系平衡、发育进程或功能能力。不应替代胚胎，而是互补工具。若通过更好定义细胞状态和体内验证改进，可成为机制研究和改善繁殖效率的桥梁。
