野生与栽培鹰嘴豆多组织蛋白质组图谱解析组成型与冷诱导型冷响应及种子贮藏蛋白分化

《Plant Stress》：Multi-tissue proteome atlas reveals constitutive and reactive cold responses in wild and domesticated chickpea

在鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）生殖发育过程中，低温会降低结荚（pod set）和产量，但导致产量损失的组织特异性蛋白质组（tissue-specific proteome）变化仍大部分未解析。研究人员量化了植株与种子表型性状（phenotypic traits），并生成了两个栽培品种（domesticated cultivars）和一个野生近缘种（wild relative）在三种受控温度制度（controlled temperature regimes）下生长的叶、花和种子的组织分辨蛋白质组（tissue-resolved proteomes）。在全部三个组织中，基因型（genotype）而非温度是蛋白质组变异（proteome variation）的主要驱动因素，且野生-栽培分离（wild-domesticated separation）在温度制度间持续存在。野生和栽培基因型表现出不同的冷响应特征（cold-response signatures），功能术语（functional terms）无重叠。冷响应酶抑制剂（cold-responsive enzyme inhibitors）在叶和花中富集；基因型特异性果糖苷酶/转化酶（fructosidase/invertase）变化表明冷条件下源组织蔗糖代谢发生改变。在高日温条件下，种子贮藏蛋白（seed storage protein, SSP）组成在野生种质（wild accession）中为11S主导，而在两个栽培品种中均为7S主导。最低日温通过11S诱导部分逆转了PBA Striker中的这一平衡。这些发现表明，在所检测的基因型中，野生与栽培背景之间的蛋白质组分离是组成型（constitutive）的，而非冷诱导（cold-induced）的。

研究背景：鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）是重要食用豆类，种子蛋白含量高，并通过生物固氮贡献土壤氮。生殖期低温损害受精并降低结荚，易感基因型产量损失超过30–40%。低于15°C可引起叶黄化坏死、花败育、花粉不育、胚珠育性受损和结荚减少。冷害低于10°C导致膜刚性化、光抑制和蛋白合成受损。冷胁迫抑制叶光合与蔗糖合成，限制碳向生殖器官输出；花药蔗糖导入减少影响脱落酸（abscisic acid, ABA）依赖的绒毡层转化酶和单糖转运蛋白，损害花粉发育；种子中蔗糖合酶和转化酶活性降低限制淀粉累积和贮藏蛋白沉积。CBF/ICE1等转录因子和代谢调节因子参与耐冷协调，但鹰嘴豆叶、花、种子跨组织蛋白质组如何协调仍不清楚。酶抑制剂在冷下组织特异代谢物积累中起作用，但其跨组织和温度制度分布未系统表征。鹰嘴豆驯化后失去春化、营养和生殖耐冷性，部分野生近缘种耐冷但多不能与栽培种杂交。野生Cicer是否比栽培品种更耐冷、差异是组成型还是冷诱导仍未知。研究人员因此对两个澳大利亚栽培品种PBA Striker、PBA HatTrick和一个野生Cicer echinospermum种质S2Drd065，在三种温度制度下生成叶、花、种子定量蛋白质组，结合差异丰度、WGCNA（weighted gene co-expression network analysis，加权基因共表达网络分析）和MOFA+（multi-omics factor analysis，多组学因子分析），并比较冷响应酶抑制剂和SSP。结论是基因型而非温度是主要驱动，野生-栽培分离持续，冷响应特征不同且功能术语无重叠，所检测基因型中蛋白质组分离为组成型而非冷诱导。意义在于为耐冷育种提供候选标记蛋白与多组织蛋白质组资源。

关键技术方法（不超过250字）：采用随机完全区组设计（randomised complete block design, RCBD）在受控环境生长两个澳大利亚栽培品种PBA Striker、PBA HatTrick与野生C. echinospermum种质S2Drd065；温度制度为13°C/7°C、15°C/5°C、23°C/4°C，12/12 h光暗，400 μmol m^-2s^-1 PAR；春化、接种根瘤菌，玻璃温室至早花后转入气候箱；按热积温（thermal degree days, TDD）采样叶、花、种子；采用FASP（filter aided sample preparation，滤膜辅助样品制备）消化，DIA-MS（data-independent acquisition mass spectrometry，数据非依赖采集质谱）定量，DIA-NN无库搜库；缺失值以KNN/中位数填补，IQR过滤，log₂转换；limma差异丰度、WGCNA、MOFA+整合、ShinyGO基因本体（Gene Ontology, GO）富集。样本队列来源：PBA Striker、PBA HatTrick、S2Drd065。

研究结果：

3.1 基因型决定生殖策略和产量。研究人员量化表型发现，基因型而非温度驱动结荚，解释总方差超过50%（η²=50.9%）。S2Drd065每株起始荚数为105±11，而栽培品种为44±2；其败育率更高（52.6±4.2% vs 29.6±2.8%），但仍保留更多饱荚（46.6±7 vs 30.8±3）。温度对地上生物量有小而显著影响（η²=13.7%），13D/7N生物量高于23D/4N。性状相关显示总荚和败荚紧密耦合，质量性状另成簇，败育率与质量负相关。

3.2 组织特异方差由基因型和温度驱动。检测到叶6317、花7161、种子4236个蛋白（1% FDR）。PCA中PC1分离基因型，PC2分离温度。方差分解显示基因型贡献最大，种子27.3%、叶19.1%、花20.2%；温度在叶11.5%、花13.3%、种子8.6%；基因型×温度（genotype-by-temperature, G×T）为叶15.8%、花13.5%、种子12.0%。花中两个低日温制度聚类较近，平均蛋白丰度呈阈值而非渐进响应；种子在15D/5N偏离最大，13D/7N部分回归23D/4N。

3.3 温度和基因型驱动组织特异蛋白质组变化。差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）计数中基因型多于温度，涉及S2Drd065的对比DAP数高，栽培品种间少。叶在15D/5N增多，种子相反。花中23D/4N升高蛋白富集嘧啶脱氧核苷酸生物合成和DNA复制，冷下受抑制；花脂氧合酶（lipoxygenases, LOX）在15D/5N呈基因型依赖抑制，HatTrick和S2Drd065下降，Striker稳定，13D/7N恢复。叶低日温蛋白富集RNA/mRNA代谢、琥珀酸转运和碳水化合物衍生物代谢；叶LOX在所有基因型冷下同等下降。种子HatTrick vs S2Drd065有480个DAPs，HatTrick富集翻译、肽合成和负调控肽酶活性，S2Drd065富集次生代谢和谷胱甘肽代谢。

3.4 模块-性状网络揭示冷和基因型效应。WGCNA得到叶24、花10、种子9个模块。叶和花温度相关模块多，种子基因型相关模块多。基因型是生殖输出主要决定因素，温度仅显著影响败荚数（η²=0.160），G×T显著（η²=0.320）。叶蓝模块与总荚和败荚相关强于饱荚，提示叶光合能力与总体生殖努力相关。花棕模块与总种子重正相关，富集叶绿体蛋白导入、叶绿素和翻译。种子栽培高丰度模块富集胞质核糖体、线粒体ATP合酶和氧化能量代谢；S2Drd065高丰度富集光系统II（Photosystem II, PSII）组分。种子turquoise模块与单株种子数r=-0.94、单种子重r=+0.56、总种子重r=+0.51，三基因型和温度制度一致，构成组成型种子大小-数量权衡。

3.5 多组织因子解析基因型冷响应。MOFA+得8个因子，解释每组织41–52%方差。Factor 1最大且基因型驱动（η²=0.85），S2Drd065位于负端，栽培品种不可区分，温度间稳定。Factor 1与败荚负相关r=-0.69，与总种子重正相关r=+0.41。S2Drd065花富集苯丙烷和芳香氨基酸代谢，叶富集蔗糖生物合成；栽培种子富集脂肪酸α-氧化，叶富集防御和胁迫响应；annexin在S2Drd065所有温度下高丰度。Factor 2/3互斥：F2为栽培特异冷开关，低温下转为正分；F3为野生特异，低温下转为负分，栽培无方向。GO不重叠：栽培冷升高羧酸/氧酸代谢、叶叶绿体组分；冷抑制叶水运输、种子线粒体组分。质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins, PIP aquaporins）在栽培叶花冷下下降，S2Drd065叶增加、花稳定。F3?种子富集抗坏血酸和乳糖生物合成，叶富集多糖生物合成。Factor 6为栽培品种间低日温种子分歧，HatTrick正、Striker负、S2Drd065近零；HatTrick富集PSII和能量生成，Striker富集种子氧化还原酶和叶质体组分。

3.6 源组织冷响应酶抑制剂与冷下种子贮藏蛋白组成。

3.6.1 酶抑制剂：鉴定97个抑制剂蛋白（叶31、花39、种子27），蛋白酶/肽酶抑制剂主导。23D/4N vs 13D/7N冷响应抑制剂集中在叶花，14个差异（叶8、花5、种子1）。叶中Cysteine proteinase inhibitor 5下降；花中Kunitz trypsin inhibitor 2-like增加，Inter alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4-like下降。15D/5N叶9个差异中8个下降，包括Kunitz PI-1和Cysteine PI5，一个果糖苷酶抑制剂增加；13D/7N Kunitz PI-1不显著，Cysteine PI5仍下降。蛋白酶/肽酶抑制剂方向组织不同：叶S2Drd065在23D/4N高、冷下下降，栽培稳定；花栽培冷下增加，S2Drd065下降；种子S2Drd065低于栽培且13D/7N进一步下降。果糖苷酶/转化酶抑制剂在S2Drd065叶所有温度高于栽培；A0A1S2YQ10在S2Drd065叶15D/5N和13D/7N增加，栽培稳定。冷响应抑制剂限于叶花，提示源组织酶抑制剂调控受冷扰动。

3.6.2 种子贮藏蛋白：7S/11S球蛋白比由基因型主要决定（η²=0.698），温度η²=0.105，G×T η²=0.160。S2Drd065所有制度11S主导（0.298±0.013），栽培7S主导（Striker 1.171±0.094、HatTrick 1.108±0.056）。Striker在13D/7N比率降至0.64±0.03，由11S诱导；HatTrick冷下比率降低，由7S抑制。白蛋白稳定。野生种质更偏11S，栽培在高日温下7S主导，与其他豆类驯化模式相反。

讨论与结论：讨论指出，一个野生和两个栽培基因型冷响应策略不同：栽培激活冷诱导蛋白质组开关，S2Drd065呈阈值响应，涉及种子抗坏血酸和叶多糖生物合成，符合持续抗氧化和细胞壁重塑。基因型是主要驱动，冷韧性反映组成型蛋白质组分化。限制包括日/夜温共变、4°C夜与7°C夜性质不同、种质代表性有限。S2Drd065组成型特征包括annexin高丰度，提示冷信号网络准备；高日温花苯丙烷/芳香氨基酸和叶蔗糖生物合成高。源-库碳动态方面，S2Drd065叶果糖苷酶/转化酶抑制剂冷下增加，栽培少；PIP aquaporins栽培冷下下降，S2Drd065叶增加、花稳定。花LOX抑制非单调，15D/5N发生而13D/7N不发生，提示特定冷阈值。种子11S/7S方面，驯化通常增11S，但本研究野生高日温更11S偏、栽培7S主导，呈倒置；冷下栽培品种机制不同。育种可关注增强生殖建成和S2Drd065组成型特征，而非仅冷诱导响应。所有解释基于蛋白质丰度和表型，应视为假设生成，需靶向蛋白质组、功能测定和qRT-PCR验证。候选包括果糖苷酶/转化酶抑制剂、aquaporins、花蛋白酶/肽酶抑制剂和LOX。研究结论翻译：这些发现表明，在所检测的基因型中，野生与栽培背景之间的蛋白质组分离是组成型的，而非冷诱导的；育种以提高冷韧性可关注与增强生殖建成相关的等位基因以及与S2Drd065相关的组成型蛋白质组特征，而不应仅依赖冷诱导响应。