基于重组Hexon L1蛋白的鸡禽腺病毒血清型8b抗体间接ELISA检测方法的建立与诊断验证

《Poultry Science》：Development and diagnostic validation of a recombinant Hexon L1-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to fowl adenovirus serotype 8b in chickens

包涵体肝炎（IBH）是由禽腺病毒（FAdVs）引起的一种严重影响家禽生产力的疾病。近期数据表明，FAdV血清型8b（FAdV-8b）是泰国IBH病例中的主要血清型。尽管血清中和（SN）试验是检测血清型特异性中和抗体的常用方法，但其常规应用存在局限性。本研究利用在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并经Ni–NTA亲和层析纯化的FAdV-8b Hexon loop-1区重组蛋白（rHexon8b），开发了一种靶向FAdV-8b的间接ELISA（iELISA）并进行了诊断验证。共使用467份具有已验证SN结果的鸡血清进行试验优化和诊断评估。在450 nm波长下测定的光密度（OD450）临界值设定为0.112，并经受试者工作特征（ROC）分析支持，该分析显示出优异的判别性能，曲线下面积（AUC）为0.96（95%置信区间：0.9407–0.9748；p < 0.0001）。以SN试验为参考标准，rHexon8b iELISA的诊断敏感性为92.73%，诊断特异性为89.33%，两种检测方法之间具有高度一致性（Cohen’s κ = 0.818）。该检测方法对主要鸡病原体阳性血清及异源FAdV血清型（包括FAdV-2和-11）均未检测到交叉反应。批内和批间变异系数分别在0.92%–6.80%和3.43%–9.46%范围内，表明该方法具有优异的重复性和精密度。研究结果表明，rHexon8b iELISA是一种快速、可重复且实用的血清学筛查工具，可用于鸡群FAdV-8b相关IBH的群体水平监测、疫苗接种监测和流行病学调查。

一、研究背景与意义

禽腺病毒（FAdVs）属于腺病毒科禽腺病毒属，为无囊膜双链DNA病毒，其二十面体衣壳主要由Hexon、Fiber和Penton base三种主要结构蛋白构成。其中Hexon蛋白含有血清型特异性中和表位，其L1区包含高变区，是FAdV血清型分类和血清学检测的关键靶标。FAdVs与家禽多种重要经济性疾病相关，包括包涵体肝炎（IBH）、肝炎-心包积液综合征（HHS）和腺病毒性肌胃糜烂（AGE）。IBH以肝细胞变性和坏死及核内包涵体为特征，可导致死亡率升高、生产性能下降、产蛋率降低、孵化率下降、雏鸡质量受损及继发感染易感性增加。多种FAdV血清型与IBH相关，其中D种（FAdV-2、-3、-9和-11）和E种（FAdV-6、-7、-8a和-8b）在田间暴发中最为常见，且优势血清型存在地域差异。泰国2007年曾报道FAdV-2与IBH相关，但近期研究显示FAdV-8b已成为优势流行株。

目前FAdV感染的实验室诊断主要依赖组织病理学、病毒分离、血清学检测、电镜和聚合酶链反应（PCR）。PCR方法虽可检测病毒DNA，但无法反映感染或免疫后的群体抗体应答水平。血清中和（SN）试验虽被视为检测血清型特异性中和抗体的参考方法，但其需要活病毒、敏感细胞培养系统、专业技术技能且周转时间长，限制了在大规模鸡群监测和常规血清学监测中的应用。酶联免疫吸附试验（ELISA）因其快速、可规模化且适应常规诊断流程，成为高通量抗体检测的实用替代方案，但其效果和特异性高度依赖所用抗原。Hexon蛋白L1区的高变区支持其作为血清型特异性血清学检测的重组抗原。泰国等多个国家采用FAdV田间毒株制备自体疫苗控制IBH，因此需要与流行血清型匹配的血清学检测方法监测免疫或自然感染后的抗体应答。已有针对FAdV-2的重组Hexon间接ELISA，但由于中和及结合抗体应答主要为血清型特异性，该检测可能不适用于FAdV-8b抗体检测。因此，开发FAdV-8b靶向ELISA对血清学监测、疫苗监测和群体水平流行病学研究具有重要意义。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员开发并验证了一种基于FAdV-8b Hexon L1区重组蛋白（rHexon8b）的间接ELISA（iELISA）。关键技术方法包括：从自然感染FAdV-8b的鸡肝脏组织中提取病毒DNA，PCR扩增含L1区的hexon基因片段并克隆至pQE-31表达载体，在大肠杆菌M15细胞中经IPTG诱导表达重组蛋白，通过Ni–NTA亲和层析在变性条件下纯化；利用Western blot验证重组蛋白的免疫反应性；以SN试验为参考标准对467份鸡血清样本（其中295份来自FAdV-8b灭活自体疫苗免疫鸡，172份来自未免疫鸡；SN阳性289份，SN阴性178份）进行检测优化和诊断评估；通过棋盘滴定确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度；采用均值加标准差法和受试者工作特征（ROC）分析确定临界值；评估诊断敏感性、特异性、与SN试验的一致性（Cohen’s κ）、分析特异性（常见禽病原体阳性血清及异源FAdV血清型）以及批内和批间重复性。

三、研究结果

重组Hexon8b表达质粒的构建： PCR成功扩增约880 bp的目标片段，克隆至pQE-31表达载体后经Sanger测序确认插入片段与FAdV-8b hexon基因高度同源。

重组Hexon8b蛋白的表达与纯化： IPTG诱导后重组蛋白主要在大肠杆菌M15细胞不溶性组分中表达，SDS-PAGE显示约35 kDa的明显蛋白条带，与预测分子量一致。变性条件下溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化，获得富集的rHexon8b蛋白。

rHexon8b蛋白的免疫反应性： Western blot显示纯化的35 kDa rHexon8b蛋白可被抗His标签单克隆抗体和FAdV-8b阳性鸡血清（1:200稀释）识别，而与FAdV-8b阴性血清无特异性反应，空载体对照抗原不与阳性血清反应，表明重组蛋白保留了抗原性。

rHexon8b间接ELISA的优化： 棋盘滴定确定最佳条件为1.88 μg/孔rHexon8b、血清稀释度1:50、山羊抗鸡IgG-HRP稀释度1:10,000。该条件下阳性血清OD₄₅₀值为0.411，阴性血清为0.057，阳性与阴性比值（P/N）为7.21。虽然1:25血清稀释度P/N比略高但背景吸光度增加，故选择1:50以平衡信号与背景。

ELISA临界值的确定： 利用172份未免疫鸡群血清（其中168份SN阴性、4份SN阳性）进行初步临界值确定，均值OD₄₅₀为0.082，标准差为0.030。均值+1 SD、+2 SD和+3 SD对应的候选临界值分别为0.112、0.143和0.173，选择0.112作为操作阈值。ROC分析验证了该临界值，ROC推导临界值同样为0.112，AUC为0.96（95% CI：0.9407–0.9748；p < 0.0001），显示优异的判别性能。

ELISA OD₄₅₀值按SN状态和SN滴度的分布： SN阳性血清的平均OD₄₅₀值（0.294）显著高于SN阴性血清（0.082）（p < 0.0001）。ELISA OD₄₅₀值总体随SN滴度升高而增加，多数SN滴度≥1:64的血清OD₄₅₀值高于临界值。467份血清中287份ELISA阳性、180份ELISA阴性。SN滴度为1:16的6份血清中仅1份ELISA阳性，该组平均OD₄₅₀值低于临界值；少数高SN滴度血清被判定为ELISA阴性。

rHexon8b iELISA的诊断性能： 以0.112为临界值，268份样本SN和iELISA双阳性，159份双阴性；不一致结果包括21份假阴性和19份假阳性。诊断敏感性为92.73%，特异性为89.33%，Cohen’s κ值为0.818，表明两种检测方法具有高度一致性。

rHexon8b iELISA的分析特异性： FAdV-8b阳性血清呈强反应，而针对新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H5和H9亚型（AIV-H5、AIV-H9）、减蛋综合征病毒（EDSV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡毒支原体/滑液支原体（MG/MS）、禽脑脊髓炎病毒（AEV）、鸡贫血病毒（CAV）及沙门氏菌D/B群（Sal./D/B）的阳性血清OD₄₅₀值均低于临界值。FAdV-2和FAdV-11阳性血清亦为阴性。交叉反应确认实验中，FAdV-8b自体疫苗免疫肉鸡的系列血清在rHexon8b iELISA中呈强反应（OD₄₅₀值0.270–0.869），但在FAdV-2 Hexon iELISA中无反应（OD₄₅₀值0.049–0.087），表明无可检测的血清型间交叉反应。

rHexon8b iELISA的重复性和精密度： 批内变异系数（CV）范围为0.92%–6.80%，批间CV范围为3.43%–9.46%，均低于10%，表明该方法具有良好的重复性和精密度。

四、讨论与结论

讨论部分指出，SN试验虽为血清型特异性抗体检测的金标准，但受限于活病毒需求、细胞培养系统、专业技能和长周转时间。重组Hexon L1抗原的选择基于其含有的高变区可实现血清型区分。大肠杆菌表达重组抗原可能存在非特异性背景问题，研究人员通过在血清稀释液中添加大肠杆菌粗蛋白降低非特异性结合。临界值确定时，未免疫参考组中4份SN阳性血清可能对临界值产生一定影响，但ROC分析验证了0.112阈值的合理性。ELISA与SN试验间的不一致主要见于低SN滴度血清（尤其1:16临界水平）及少数高SN滴度但ELISA阴性样本，后者可能归因于重组蛋白在变性条件下纯化且未进行复性，导致部分构象表位丢失。SN试验检测针对完整病毒的功能性中和活性，而iELISA检测针对特定重组Hexon8b片段结合抗体，两者检测的抗体特性存在本质差异。分析特异性方面，该方法对常见禽病原体和异源FAdV血清型（FAdV-2、-11）无交叉反应，且FAdV-8b免疫血清在FAdV-2 Hexon iELISA中无反应，支持其血清型特异性，但应谨慎使用“血清型特异性”表述。重复性和精密度指标符合免疫检测可接受标准。

研究结论：本研究开发的基于重组Hexon8b的间接ELISA展现出优异的诊断性能，与SN试验具有高度一致性，重复性可接受，且对评估的禽病原体和异源FAdV血清无交叉反应。该方法为检测鸡FAdV-8b抗体提供了实用、可规模化的血清学手段，有助于FAdV-8b相关IBH的鸡群水平监测、疫苗接种评估和流行病学调查。进一步使用更广泛的异源FAdV血清型组合、纵向血清和自然感染田间群体进行验证，将加强其作为常规诊断检测方法的应用。