人诱导多能干细胞（iPSC）来源脊髓模式球状体模型用于研究髓鞘损伤、碎片清除与再髓鞘化并实现多发性硬化相关药物筛选

《Nature Neuroscience》：A human-induced pluripotent stem cell-derived spheroid model to investigate myelin injury and repair

　　

目前尚无获批疗法可促进髓鞘损伤后的新髓鞘形成，部分原因可归因于缺乏能够可重复模拟这些过程的可靠系统。在此，研究人员构建了人诱导多能干细胞（iPSC）来源的球状体（spheroid）模型，该模型富含成熟、形成髓鞘的少突胶质细胞（oligodendrocytes）和具有功能性反应性的小胶质细胞（microglia）。该模型通过再现髓鞘损伤和修复过程，使研究人员能够研究脱髓鞘损伤后的人中枢神经系统（CNS）再髓鞘化。这些过程包括髓鞘碎片化、小胶质细胞反应性和对髓鞘碎片的吞噬作用、少突胶质细胞生成和分化，以及轴突被新形成髓鞘包绕。研究人员表明，新生成的少突胶质细胞参与再髓鞘化，并利用超微结构定量证明，损伤后再髓鞘化轴突被较薄的髓鞘包绕。总之，研究人员提供了模型以探究与多发性硬化（MS）相关的人髓鞘生物学中原本难以触及的方面，为疾病通路提供机制性见解，并提供药物筛选平台。

中枢神经系统（CNS）中的轴突由少突胶质细胞（oligodendrocytes）产生的髓鞘包绕。髓鞘和少突胶质细胞均可在CNS损伤中被破坏，进而导致功能缺陷和不可逆神经退行性变。CNS具有一定能力生成新髓鞘，该修复过程称为再髓鞘化（remyelination）。目前，这些动态再髓鞘化过程只能在动物模型中研究。尽管已在人髓鞘生物学与非人动物模型之间发现保守分子机制，但细胞行为差异明显，因此亟需改进的、与人相关的模型系统以推动对人髓鞘生物学的机制理解。目前尚无获批疗法可促进髓鞘损伤后的新髓鞘形成，部分原因在于缺乏能够可重复模拟这些过程的可靠系统。该论文发表在《Nature Neuroscience》。研究人员利用iPSC来源系统生成球状体，以模拟人髓鞘损伤和修复，建立可提供机制见解并潜在用于识别促进少突胶质细胞再生和髓鞘修复疗法的平台。

关键技术方法概要：研究人员使用人iPSC系18a（雌性对照系，由K. Eggan提供）、C005（雌性对照系，由本机构从捐赠成纤维细胞重编程，经University of Melbourne Human Research Ethics Committee批准，编号1749960.1）和PB001-tdTomato（雄性对照系，由E. Stanley提供）。构建脊髓模式球状体，在成熟阶段播种iPSC来源巨噬细胞样前体并分化为小胶质细胞；以溶血卵磷脂（LPC）诱导脱髓鞘，用乙炔脱氧尿苷（EdU）标记新生成细胞；采用免疫荧光、多重免疫标记、单细胞RNA测序、透射电子显微镜（TEM）、聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）、相关光电子显微镜（CLEM）和G比率（G-ratio）分析；并用富马酸氯马斯汀进行再髓鞘化药物验证。

研究结果如下。

生成富含髓鞘化少突胶质细胞和反应性小胶质细胞的iPSC来源球状体：研究人员首先构建含髓鞘化少突胶质细胞和功能性小胶质细胞的iPSC来源CNS球状体。宿主球状体为脊髓模式球状体，富含广泛且成熟的髓鞘化少突胶质细胞。研究人员将单独分化的iPSC来源巨噬细胞样前体细胞在成熟培养3周时播种入球状体。通过内在信号，这些巨噬细胞样细胞在成熟11周时成功分化为小胶质细胞，表现为CD45⁺表达显著降低（P=0.02），P2RY12⁺和CX3CR1⁺表达富集。tdTomato荧光报告基因活成像显示其成功整合入球状体，并对刺激具有动态反应性。存在免疫细胞时，球状体仍保留广泛且成熟的髓鞘化少突胶质细胞。因此，该系统为探究与人髓鞘生物学相关的疾病过程提供了基础。

LPC触发球状体中髓鞘碎片化，且小胶质细胞对髓鞘损伤作出反应：研究人员使用0.1 mg ml^?1 LPC处理球状体16 h以触发脱髓鞘，随后去除LPC并定义为0时点。LPC处理球状体显示出显著髓鞘破坏和碎片化，高通量分析显示所有时间点平均髓鞘长度更短，第二iPSC系可重复该表型，且该表型在LPC去除后28天清除。自动化分析显示，单位NF-h⁺轴突面积内长度大于20 μm的MBP⁺髓鞘密度存在显著LPC主效应（P=0.011）。LPC去除后24 h和7天未检测到少突胶质细胞死亡证据；LPC去除后5 h SOX10⁺少突胶质细胞密度下降不显著，而PDGFRα⁺密度增加；24 h后PDGFRα⁺少突胶质细胞前体细胞（OPC）比例较vehicle显著增加（P<0.0001）。LPC还破坏旁结组装，claudin-11沿脱髓鞘轴突分散，TEM显示髓鞘损伤。因此，LPC在系统中成功引起髓鞘损伤、碎片化和碎片产生。

小胶质细胞通过吞噬髓鞘碎片对髓鞘损伤作出反应：研究人员发现小胶质细胞形态在全球状体水平无一致变化，但个体胞体面积分布不同。多重荧光免疫标记单细胞分析显示，IBA1⁺小胶质细胞中HLA-DR水平在LPC去除后24 h和7天较vehicle显著增加，效应量Cohen’s d>0.8；IBA1、CD68和L-ferritin水平无差异。LPC去除后7天和14天，IBA1⁺小胶质细胞内MBP⁺信号共定位显著增加，匹配iPSC对照系验证可重复。CLEM显示小胶质细胞溶酶体结构内充满与髓鞘碎片一致的电子致密物质。二维单培养中，iPSC来源小胶质细胞可吞噬珠子；脂多糖刺激后，IL-6、TNF和IL-10分泌中度增加，IL-13不增加。因此，这些数据支持小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬清除。

LPC后24 h球状体单细胞RNA测序显示与vehicle处理球状体的差异：研究人员对LPC去除后24 h球状体与vehicle处理球状体进行单细胞测序。培养物富集少突胶质细胞、OPC、星形胶质细胞、神经元和播种的小胶质细胞。少突胶质细胞中，LPC处理后有221个基因上调、160个基因下调；与已发表人MS病灶死后组织数据相似，出现离子通道调控和少突胶质细胞应激相关上调，KCNMB4和HSPB1特异性上调，FMN1增加，actin相关通路富集；下调通路包括少突胶质细胞分化相关通路。OPC中，637个基因上调、2708个基因下调；细胞分裂通路显著上调；MHC-I相关、MHC-II相关及更广泛免疫相关基因如IRF9、CDKN1a和TNFRSF12A被触发。小胶质细胞中，228个基因上调、188个基因下调；上调通路涉及脂质代谢和MHC class II组织及抗原呈递，下调通路涉及白细胞活化和迁移。Spearman相关分析证实，24 h LPC球状体数据与活动性MS病灶中失调基因显著关联；少突胶质细胞数据与两个独立活动性MS病灶数据集显著重叠（Fisher精确检验P<0.0001）。因此，该模型在基因和通路水平镜像MS病灶形成的关键疾病通路。

髓鞘损伤后，少突胶质细胞增殖并形成新的致密髓鞘：研究人员从LPC去除时开始补充EdU，以区分存活髓鞘化少突胶质细胞和由前体细胞增殖分化形成的新细胞。LPC处理球状体中，新生成少突胶质细胞占全部少突胶质细胞比例显著增加。再髓鞘化球状体中，髓鞘需可见地通过细胞质突起附着于少突胶质细胞胞体，结间段两侧有旁结，横截面显示同心致密膜层包绕轴突，符合真正髓鞘标准。新生成少突胶质细胞中已开始形成髓鞘的比例在LPC去除后8周（P=0.0002）和12周（P=0.035）显著增加。长度超过20 μm的MBP⁺髓鞘与NF-h⁺轴突共定位无显著差异（P_{LPC effect}=0.66，P_LPC×time=0.90），支持再髓鞘化。claudin-11在LPC后4周几乎不可见，8周和12周可见旁结建立，20周仍可见。FIB-SEM确认LPC去除后8周存在沿轴突投射的致密髓鞘。LPC处理球状体的G-ratio高于vehicle处理球状体（P<0.0001），提示再髓鞘化轴突髓鞘更薄，这是初始再髓鞘化反应的特征。因此，人OPC能够响应脱髓鞘损伤而增殖、分化并髓鞘化；同时存在EdU阴性髓鞘化少突胶质细胞，提示LPC后出现的髓鞘也可能来自现有少突胶质细胞的再髓鞘化。

LPC后8周球状体单细胞RNA测序显示与vehicle处理球状体的差异：在8周LPC处理球状体与vehicle比较中，少突胶质细胞（未区分新生成或现有）TPPP和ERMN显著上调、GPR17下降，这些基因均与人类再髓鞘化区域和小鼠MS模型失调一致。OPC中关键上调基因与线粒体功能相关，包括MT-CYB、MT-CO2、MT-ND4、MT-ND3和MT-ATP6；考虑到OPC分化和髓鞘产生的能量需求，这一发现并不意外，线粒体功能障碍在MS领域已有相关概念，且MT-ND3和MT-CYB突变在MS患者中更突出。小胶质细胞中177个基因上调、74个基因下调，细胞骨架重塑相关通路显著上调，该通路也见于人再髓鞘化病灶。因此，LPC处理球状体的再髓鞘化过程与人类再髓鞘化具有一致性，并提示潜在生物学通路。

LPC后富马酸氯马斯汀治疗促进新髓鞘化少突胶质细胞生成：研究人员在再髓鞘化实验中加入富马酸氯马斯汀（1 μM）处理，该药是首个进入MS临床试验的有效再髓鞘化药物。与不含生长因子培养基中培养的LPC处理球状体相比，氯马斯汀处理显著增加新髓鞘形成，而vehicle处理球状体无变化。这突出表明该模型系统具有用于药物筛选的潜力。

讨论部分总结：髓鞘病理是许多神经疾病的标志特征。MS中髓鞘及产生髓鞘的少突胶质细胞净丢失导致不可逆神经退行和功能下降，但尚无获批疗法可促进MS患者髓鞘修复，尽管临床前动物模型已有成功，因此急需人源模型系统以识别机制并筛选促进髓鞘修复的药物。研究人员生成iPSC来源球状体，模拟MS相关关键疾病过程，包括髓鞘碎片化和反应性小胶质细胞清除髓鞘碎片；并显示脱髓鞘后产生的人少突胶质细胞能够形成新髓鞘，且该过程可被氯马斯汀增强，证明该系统可用于药物验证/筛选。讨论指出，再髓鞘化驱动因素仍有争议；动物研究证明再髓鞘化可由存活少突胶质细胞或新生成少突胶质细胞完成，但人组织缺乏直接证据表明CNS实质内人OPC可在脱髓鞘后增殖、分化并生成新髓鞘化少突胶质细胞。该模型克服了这一障碍，虽然不能明确界定LPC后存活少突胶质细胞，但数据清楚表明人少突胶质细胞可在脱髓鞘损伤后增殖、分化和形成新髓鞘，提供了体外人类再髓鞘化证据，并建立了识别和定量新髓鞘的流程。模型优势在于可验证在动物模型或较简单高通量平台中显示有效的候选治疗靶点，并可量化致密髓鞘变化。局限包括：iPSC来源类器官/球状体在成熟度上转录上类似胎儿人脑，而MS主要影响成人；类器官本身存在不同球状体间和不同分化间变异，iPSC系间也存在变异，18a球状体髓鞘化较C005更明显；仅50%分化成功再髓鞘化，且未再髓鞘化的分化通常初始髓鞘化也较差；29个18a独立分化中69%有髓鞘，其余很少或无髓鞘。尽管存在这些局限，该模型仍为具人细胞相关性的生物机制探究和药物筛选/验证提供了重要途径。

研究结论翻译：总之，研究人员成功生成了含反应性小胶质细胞的iPSC来源髓鞘化球状体，并用这些球状体模拟MS病理的关键方面。对MS相关损伤作出反应时，髓鞘发生碎片化，产生的髓鞘碎片被清除。研究人员证明，人少突胶质细胞能够响应髓鞘损伤而增殖、分化并成功生成新髓鞘，且该范式可通过药物治疗复制。这也是唯一能够在修复背景下定量髓鞘超微结构的人源系统。因此，研究人员得出结论：该模型系统的建立具有巨大潜力，可用于识别促进新少突胶质细胞生成和新髓鞘形成的疗法。