整合代谢组与转录组解析四种油菜花瓣颜色的基因-代谢物图谱及其花色育种应用前景

《Scientia Horticulturae》：Integrated metabolome and transcriptome landscape of four rapeseed petal colors provides a candidate gene-metabolite roadmap for flower color breeding

： 油菜（Brassica napus L.）是中国主要的油料作物，年种植面积超过1亿亩。花瓣颜色作为油菜重要的表型性状，受环境影响较小，具有稳定的遗传性和明显的表型特征，被广泛用作育种中的标记性状。彩色油菜花的开发利用也有助于乡村振兴和支撑地方经济可持续发展。彩色油菜品种具有花期长、花量多、色彩多样、观赏价值高、易于管理等多重优势。油菜花瓣通常为黄色或乳白色，近年来育种家通过人工杂交、诱变育种和基因工程等手段培育出酒红、深红、深紫、浅紫、亮黄、浅黄、乳白、纯白、橙红等多种花色品种。 花色主要由色素的种类和含量决定，其中花青素在花瓣着色中发挥核心作用。植物色素一般分为四类：酚类色素（以类黄酮为代表）、吡咯衍生物（以叶绿素为代表）、酮类和醌类衍生物（以生物碱为代表）以及萜类色素（以类胡萝卜素为代表）。类黄酮包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮和花青素等，其中黄酮和黄酮醇通常呈黄色或无色。花青素中的天竺葵素、飞燕草素和矢车菊素分别赋予砖红色、蓝紫色和紫红色。甲氧基化衍生物如芍药素、矮牵牛素和锦葵素也参与着色，其中芍药素产生紫红色，矮牵牛素和锦葵素可产生蓝紫色调。橙酮和查尔酮常共存于同一花瓣中，产生深黄色色素。 油菜花瓣着色受复杂过程调控，目前仅鉴定出少数与该性状相关的基因。白色花瓣中花青素合酶（ANS）、黄酮醇合酶1（FLS1）和MYB转录因子4（MYB4）的表达水平低于玫红色花瓣，而查尔酮合酶（CHS）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、ANS和MYB4在玫红色花瓣中的表达高于白色花瓣。在杏红色和粉色花瓣中，花青素生物合成相关的结构基因以及三个关键转录因子BnaMYBL2、BnaA0.PAP2和BnaTT8较黄色或白色花显著上调。特别是BnaA07.PAP2的高表达可激活花青素途径中的基因，促进花瓣中花青素积累，最终导致油菜红色着色。通过酵母双杂交（Y2H）、亚细胞定位、双分子荧光互补（BiFC）和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明BnbHLH92a负调控油菜花青素和原花青素生物合成。转录调控因子OvPAP2（R2R3 MYB）在诸葛菜红色和紫色花瓣中高表达，但在黄色油菜花瓣和诸葛菜白色花瓣中低表达，提示OvPAP2可能是油菜花瓣花青素生物合成的关键转录调控因子。 油菜花的观赏价值日益受到育种家关注，多个中国育种项目已开发出花色多样的新品种。通过整合代谢组学、RNA测序和RNA干扰技术，研究人员利用代谢组学阐明了BnaA03.ANS在红色花瓣色素沉着中的作用，证明其在红色形成中具有不可或缺的功能。随后进一步整合多组学数据解析了多个油菜品系花色变异的分子基础。尽管取得了上述进展，迄今为止尚无研究在统一分析框架内同时建立白色、黄色、深紫色和深红色表型之间的花色特异性基因-色素关联。本研究选取四种不同花色（白色、黄色、深紫色和深红色）的油菜花瓣作为实验材料，利用高通量测序在盛花期生成花瓣转录组数据，通过整合转录组和代谢组分析确定基因表达和代谢物积累的差异，并利用实时荧光定量PCR验证类黄酮生物合成相关候选基因的表达模式。本研究旨在阐明油菜花瓣着色的分子机制，为培育观赏价值更高的彩色新品种奠定基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

油菜（Brassica napus L.）是我国最重要的油料作物，年种植面积超过1亿亩。花瓣颜色作为油菜的重要农艺和观赏性状，具有遗传稳定、表型明显、受环境影响小等优点，被广泛用作育种标记性状。近年来，随着乡村振兴战略和农旅融合发展的推进，彩色油菜花的经济价值和观赏价值日益凸显，培育花色多样的油菜新品种已成为育种工作的重要方向。然而，油菜花瓣着色的分子机制尚未被完全解析，目前仅鉴定出少数参与花色调控的基因，如ANS、FLS1、MYB4、BnaA07.PAP2、BnbHLH92a和OvPAP2等。已有研究多聚焦于黄色到紫色之间的转变，或仅对广泛色系进行笼统分析，未能从生化层面清晰区分深紫色与深红色花瓣的色素差异。特别是，区分深紫色和深红色油菜花瓣的特异性酰化矢车菊素衍生物尚未被表征。因此，在统一分析框架内同时建立白色、黄色、深紫色和深红色四种表型之间的基因-色素关联，系统解析花色形成的代谢基础和转录调控网络，对于理解油菜花色多样性的生化与分子基础、加速新型彩色品种选育具有重要的理论意义和应用价值。

二、研究内容与主要结论

本研究选取白色（W）、黄色（Y）、深紫色（DP）和深红色（DR）四种花色的油菜品种为材料，在盛花期采集花瓣样本，通过整合靶向类黄酮代谢组学、转录组学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和启动子顺式作用元件分析，系统解析了不同花色油菜花瓣的代谢物积累特征、差异表达基因（DEGs）及其调控网络。研究共鉴定出543种类黄酮代谢物，分属10个亚类，包括158种黄酮醇、147种黄酮、104种花青素、51种黄烷酮、24种查尔酮、13种黄烷酮醇、13种黄烷醇、8种鞣质、3种橙酮和22种其他类黄酮。代谢组聚类分析和主成分分析（PCA）显示四种花色样本间差异显著、组内重复性良好。差异积累代谢物（DAMs）筛选结果表明，白色与黄色比较中有26个DAMs，白色与深紫色比较中有213个DAMs，白色与深红色比较中有222个DAMs，深紫色与深红色比较中有80个DAMs。黄色花瓣中显著富集柽柳黄素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷和4′-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查尔酮；深紫色花瓣中大量积累矢车菊素-3-O-(6″-O-咖啡酰)槐糖苷-7-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-阿魏酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷；深红色花瓣中芍药素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷含量极高。转录组分析共获得97.01 Gb清洁数据，鉴定出28,606个DEGs。KEGG富集分析显示类黄酮生物合成途径在花色形成中发挥核心作用。通过整合分析，研究建立了花色特异性基因-色素关联图谱：黄色花瓣中CHS和FLS2高表达促进查尔酮和黄酮醇积累；深紫色花瓣中ANS1、CCoAAT2和CCoAOMT协同作用合成酰化矢车菊素衍生物；深红色花瓣中ANS1/MT2模块驱动芍药素-3-O-葡萄糖苷的生成。WGCNA分析鉴定出五个花色特异性枢纽转录因子（MYB12、MYB114、MYB122、bHLH21和bHLH96），其表达水平与色素丰度高度相关（|r|>0.9）。启动子顺式元件分析发现候选结构基因CHS、ANS1、UGT、MT2和CCoAAT2的启动子区域均含有MYB和bHLH结合基序，支持这些转录因子可能通过直接结合结构基因启动子调控花青素生物合成的模型。qRT-PCR验证了12个候选基因（7个结构基因和5个转录因子）的表达模式与RNA-seq数据一致，证实了转录组分析的可靠性。该研究首次在统一框架内建立了四种油菜花色表型之间的基因-色素关联图谱，为花色育种提供了可直接检验的分子标记和CRISPR靶点，对加速新型彩色油菜品种选育和提升油菜花旅游价值具有重要意义。

三、主要技术方法

本研究采用以下关键技术方法：（1）靶向类黄酮代谢组学分析：利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对四种花色油菜花瓣进行代谢物鉴定和定量分析，结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）筛选差异积累代谢物（DAMs）；（2）转录组测序（RNA-seq）：基于Illumina测序平台对12个花瓣样本（4个品种×3个生物学重复）进行高通量测序，利用HISAT2比对到油菜参考基因组（Brassica napus v2.0；NCBI accession GCF_000686985.2），DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）；（3）加权基因共表达网络分析（WGCNA）：利用28,606个DEGs和9个DAMs构建共表达模块，鉴定与花色相关代谢物高度关联的转录因子；（4）启动子顺式作用元件分析：利用PlantCARE数据库预测候选基因启动子区域（翻译起始位点上游2000 bp）的转录因子结合位点；（5）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：以β-actin为内参基因，采用2?ΔΔCt法验证12个候选基因的表达模式。实验材料为陕西省汉中市汉台区试验田（107.02 E，33.13 N）种植的四种花色油菜品种，花瓣于2023年3月21日盛花期采集。

四、研究结果

1. 1.
   四种油菜花瓣的代谢组学分析：通过UPLC-MS/MS共鉴定出543种类黄酮代谢物，分属10个亚类。聚类分析、PCA和Pearson相关性分析均表明四种花色样本间差异显著、组内重复性良好，数据可靠，适合后续差异代谢物筛选。
2. 2.
   四种油菜花瓣中的差异积累代谢物：根据VIP≥1且FC≥2或FC≤0.5的筛选标准，白色与黄色比较中鉴定出26个DAMs（14个上调、12个下调），黄色花瓣中柽柳黄素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷（FC=3.29）和4′-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查尔酮（FC=3.19）显著富集；白色与深紫色比较中鉴定出213个DAMs（173个上调、40个下调），矢车菊素-3-O-(6″-O-咖啡酰)槐糖苷-7-O-葡萄糖苷（FC=2.39×10?）和矢车菊素-3-O-阿魏酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷（FC=2.32×10?）在深紫色花瓣中大量积累；白色与深红色比较中鉴定出222个DAMs（186个上调、36个下调），芍药素-3-O-葡萄糖苷（FC=2.57×102）和山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷（FC=4.70×102）在深红色花瓣中高丰度积累；深紫色与深红色比较中鉴定出80个DAMs（55个上调、25个下调）。KEGG富集分析显示这些DAMs显著关联到代谢途径、类黄酮和黄酮醇生物合成途径、花青素生物合成途径及类黄酮生物合成途径。
3. 3.
   转录组和差异表达基因分析：共获得97.01 Gb清洁数据，Q30碱基比例不低于94%，比对率介于88.61%至95.05%之间。共鉴定出28,606个DEGs，其中白色与黄色比较中有9273个（5718个上调、3555个下调），白色与深紫色比较中有14,600个（7886个上调、6714个下调），白色与深红色比较中有13,785个（6425个上调、7360个下调），三个比较共有2778个DEGs。GO分析显示各花色间代谢相关DEGs比例相近（约82.7%）。KEGG富集分析表明类黄酮生物合成途径在花瓣着色中发挥核心作用，富集的结构基因包括CHS、CHI、FLS、ANS、UGT85A、CCoAOMT、CCoAAT和MT。
4. 4.
   类黄酮生物合成结构基因的差异表达：通过DEGs和DAMs共注释到花青素生物合成途径，构建了12个DEGs和9个DAMs的关联网络。CHS、CHI和FLS在黄色花瓣中高表达，促进4′-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查尔酮和柽柳黄素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷积累；CCoAAT1、CCoAAT2和CCoAOMT在深紫色花瓣中表达最高，催化矢车菊素-3-O-阿魏酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-(6″-O-咖啡酰)槐糖苷-7-O-葡萄糖苷的合成；ANS、UGT和MT在深红色花瓣中高表达，ANS催化无色花青素转化为矢车菊素，UGT催化矢车菊素生成矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，MT催化其转化为芍药素-3-O-葡萄糖苷，同时FLS高表达促进山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷积累。
5. 5.
   WGCNA鉴定参与类黄酮生物合成的转录因子：共鉴定出2275个转录因子，主要属于MYB、bHLH、WRKY、AP2/ERF、bZIP和NAC家族。WGCNA构建了22个共表达模块，其中black、brown、yellow、green和blue五个模块与九个类黄酮相关DAMs高度关联，包含18个MYB基因和14个bHLH基因。基于|r|>0.8的相关性阈值构建了转录因子-结构基因-代谢物互作网络，MYB12、MYBb15、MYB114、MYB122-1、bHLH21、bHLH96和bHLH45与一个或多个结构基因和DAMs显著相关。启动子分析显示CHS、ANS1、UGT、MT2和CCoAAT2的启动子均含有MYB和bHLH结合基序，支持这些转录因子作为结构基因上游调控因子的模型。
6. 6.
   qRT-PCR验证RNA-seq结果：对7个结构基因（CHS、ANS1、UGT、CCoAAT2、CCoAOMT、FLS2和MT2）和5个转录因子（MYB122-1、MYB114、MYB12、bHLH21和bHLH96）进行qRT-PCR验证，结果与RNA-seq数据一致。CHS和FLS2在黄色花瓣中高表达，ANS1、CCoAAT2和CCoAOMT在深紫色花瓣中高表达，ANS1和MT2在深红色花瓣中高表达，证实了这些基因在花色形成中的关键作用。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过整合靶向类黄酮代谢组（543种代谢物）、转录组、WGCNA和启动子顺式元件分析，首次在统一框架内解析了四种离散花色表型（白色、黄色、深紫色和深红色）的基因-色素关联。黄色花瓣的形成主要归因于查尔酮和黄酮醇的积累，其中CHS高表达促进4′-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查尔酮的合成，FLS高表达促进柽柳黄素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷的积累。深紫色花瓣的特征性色素为酰化矢车菊素衍生物，即矢车菊素-3-O-(6″-O-咖啡酰)槐糖苷-7-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-阿魏酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷，由ANS1、CCoAAT2和CCoAOMT协同催化合成。深红色花瓣的主要色素为芍药素-3-O-葡萄糖苷，由ANS1和MT2模块驱动从矢车菊素-3-O-葡萄糖苷经甲基化生成，同时山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷可能作为辅色素与芍药素-3-O-葡萄糖苷结合产生增色效应，增强红色表现，但该假设需通过体外辅色素实验和紫外-可见光谱分析验证。WGCNA鉴定出五个花色特异性枢纽转录因子（MYB12、MYB114、MYB122、bHLH21和bHLH96），其表达水平与色素丰度高度相关，启动子顺式元件分析和表达相关性支持这些转录因子通过直接结合结构基因启动子调控花青素生物合成的模型，但物理互作和转录激活功能仍需通过酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移实验（EMSA）和双荧光素酶报告实验等进一步验证。

研究结论：白色花瓣的特征性代谢物为柽柳黄素-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3,7-O-二葡萄糖苷。黄色花瓣积累柽柳黄素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷和4′-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查尔酮，与CHS和FLS2的高表达相关。深紫色花瓣通过ANS1、CCoAAT2和CCoAOMT的协同作用合成矢车菊素-3-O-(6″-O-咖啡酰)槐糖苷-7-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-阿魏酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷。深红色花瓣通过ANS1/MT2模块产生芍药素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷。WGCNA鉴定出五个类黄酮特异性枢纽转录因子（MYB12、MYB114、MYB122、bHLH21和bHLH96），其转录水平与色素丰度紧密对应。深紫色花瓣中特异性酰化矢车菊素衍生物和深红色花瓣中芍药素基色素的鉴定，连同相关的MYB/bHLH候选调控因子，推进了对油菜花瓣颜色多样性生化与转录基础的理解。该研究为育种家提供了可直接检验的分子标记和CRISPR靶点，可加速新型花色变异的开发，增强油菜的花卉旅游价值。