基于CRISPR-Cas12a2 RNA附带活性的SURE系统实现高效通用微生物基因组编辑

《Nature Communications》：Repurposing Cas12a2-mediated abortive infection for efficient and low-toxicity microbial genome editing

摘要

CRISPR-Cas 系统彻底改变了微生物基因组工程，然而反向筛选策略通常依赖于靶向 DNA 切割，其中双链断裂的严重细胞毒性限制了转化效率和克隆恢复。在此，我们提出一种创新策略，SuCas12a2-Universal Recombination Editing（SURE），通过重新利用靶向 RNA 的 CRISPR-Cas12a2 系统来规避这些局限性。相反于直接攻击基因组，SURE 利用 Cas12a2 的 RNA 触发的附带活性来诱导一种类似流产感染的状态，提供强效但可恢复的选择压力。与基于 Cas9 或 Cas12 的系统相比，该策略将转化效率提高了多达 1,000 倍，同时在大肠杆菌MG1655 中实现了超过 90% 的基因敲除、插入和替换编辑效率。我们将其扩展到多种物种，包括枯草芽孢杆菌BSZR 和希瓦氏菌MR-1，从而验证了 SURE 平台的广泛效用。从机制上讲，我们确定附带双链 DNA 降解是驱动高效筛选的决定性因素。最后，我们将此系统应用于工程化改造大肠杆菌MG1655 以高效同化塑料单体乙二醇，展示了其实际效用。总之，本工作建立了一个通用且稳健的 RNA 引导编辑框架，解决了传统靶向 DNA 方法固有的毒性 - 效率权衡问题。