《Cells》：Motor Neuron Disease in a Dish: The Power of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Spinal Motor Neurons and Glial Cells
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诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）通过为研究复杂人类疾病提供前所未有的机会，彻底改变了疾病建模领域。其中，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）作为最常见的
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）通过为研究复杂人类疾病提供前所未有的机会，彻底改变了疾病建模领域。其中，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）作为最常见的成人起病运动神经元疾病，充分体现了这种复杂性。该疾病不仅因其显著的临床和分子异质性而极具挑战性，还源于运动神经元与邻近非神经元细胞（尤其是星形胶质细胞）之间的复杂相互作用，后者对疾病进展具有重要贡献。研究人员从人类iPSCs生成患者特异性的脊髓运动神经元和星形胶质细胞的能力，使得开发能够重现ALS关键病理特征的体外模型成为可能，这些模型为研究疾病机制、识别治疗靶点以及支持个性化医疗方法提供了宝贵的平台。在本综述中，研究人员总结了当前基于iPSCs的ALS建模策略，重点介绍了其在研究疾病病理生理学和药物开发中的应用。此外，还讨论了先进的人类iPSC衍生技术，包括类器官（organoids）和器官芯片（organ-on-a-chip）系统，强调了它们的潜力、当前局限性及未来前景。
论文主体内容总结
1. iPSCs：建立多能性与分化之间的分子桥梁
1.1. iPSCs的发现彻底改变了生物医学研究
人类干细胞因其携带目标患者群体的遗传组成，并具有自我更新或在适当引导下分化成不同胚层细胞的能力，成为疾病建模和细胞治疗的理想候选者。然而，人胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的使用受到伦理问题及免疫排斥风险的阻碍。2006年iPSCs的发现绕过了这些伦理问题，并使得晚发性、散发性疾病的建模成为可能。Takahashi和Yamanaka鉴定出四种转录因子的最小组合，即八聚体结合转录因子4（Oct4）、性别决定区Y框转录因子2（Sox2）、Krüppel样因子4（Klf4）和c-Myc，后被称为"山中因子"或"OSKM因子"，其异位表达可诱导鼠和人成纤维细胞重编程为多能样状态。
1.2. 机遇与优势
iPSC技术最具革命性的方面之一是能够生成人类细胞模型，重现与患者遗传图谱直接相关的病理特征，这对于由复杂基因重排或多基因基础引起的疾病尤为重要。iPSCs允许在疾病自然发生的遗传背景下研究特定疾病，补充了传统动物模型。此外，这些细胞模型允许分析临床症状出现之前的早期分子和细胞改变，这对于神经退行性疾病尤为关键，因为死后组织分析只能研究疾病终末阶段的过程。iPSCs还为再生医学和细胞治疗开辟了新前景。值得注意的是，2026年3月，日本厚生劳动省有条件批准了两种基于iPSC衍生细胞的疗法，即用于心力衰竭的心肌细胞和用于帕金森病（Parkinson's disease，PD）的多巴胺能神经元。iPSCs还提供了实验灵活性，可结合不同细胞群体进行共培养以研究其相互作用，并可自组织成模拟体内脑结构的三维（3-dimensional，3D）结构，即大脑类器官。
1.3. 挑战与局限性
iPSC衍生产品的临床转化面临若干挑战，最严重的是细胞异质性，包括分化细胞的不成熟性和低保真度。单细胞RNA测序（scRNAseq）分析揭示了这些制备物中存在不同成熟程度的细胞连续体以及偏离预期分化路径的细胞。这些特征在临床环境中带来致瘤性和免疫原性风险，即使少量未分化细胞残留也可能形成肿瘤。此外，不同iPSC细胞系可能因供体、重编程方法和分化方案的不同而表现出显著变异性。CRISPR/Cas技术使科学家能够以空前的灵活性操纵靶细胞基因组，应用于iPSCs时可生成同基因系。其他限制包括生产成本高、分化方案劳动密集且耗时，以及iPSC衍生神经元在转录组水平上更接近胎儿而非成人原代脑细胞。为强制iPSC衍生模型衰老，研究人员探索了多种方法，包括表达早老素（progerin）、缩短端粒、药理学干预以及利用微重力加速衰老。
2. 运动神经元疾病：从神经元变性到网络功能障碍
运动神经元疾病（motor neuron diseases，MNDs）是一组以上运动神经元（upper motor neurons，UMNs）和/或下运动神经元（lower motor neurons，LMNs）变性为特征的严重神经系统疾病。UMNs变性导致肌肉僵硬、痉挛、反射亢进和肌张力增高；LMNs变性破坏肌肉收缩的最终通路，导致进行性肌无力、肌束颤动、反射减退或消失以及萎缩。肌萎缩侧索硬化症（ALS）同时涉及上下运动神经元的变性。ALS的全球发病率估计约为每年每10万人1-2例，患病率为每10万人4-8例。约90-95%的病例为散发性ALS（sALS），其余5-10%为家族性ALS（fALS）。SOD1、C9orf72、TARDBP和FUS基因的突变占家族性病例的50-70%。目前仅有少数疾病修饰治疗获批，包括利鲁唑（Riluzole）、依达拉奉（Edaravone）和托夫生（Tofersen），但这些治疗仅提供有限益处。
3. 在培养皿中建模ALS：人iPSCs向运动神经元的分化
3.1. 下运动神经元建模
Dimos等人首次从一名82岁家族性ALS女性患者的iPSCs生成脊髓运动神经元，使用维甲酸（retinoic acid，RA）促进尾部化获得脊髓规格，以及音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信号通路激动剂驱动腹侧化。Du等人开发了化学成分明确的分化策略，可在约两周内生成高度富集的运动神经元祖细胞群，约95%表达少突胶质细胞转录因子2（OLIG2）。随后可将其分化为共表达HB9、ISL1/2和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的成熟胆碱能运动神经元。研究人员证明，根据该方案分化的大多数脊髓运动神经元表现出成熟细胞的电生理特征。一项来自100名sALS患者的iPSC文库研究检测到患者与健康人来源运动神经元之间的显著差异，患者来源细胞表现出存活率降低和神经突变性加速，且与供体生存时间相关。
3.2. 上运动神经元建模
上运动神经元（Betz细胞）是位于运动皮层第V层的小群大型锥体谷氨酸能神经元。单细胞RNA测序研究揭示其转录组与额叶皮层第V层的von Economo神经元（VENs）几乎无法区分。目前仍缺乏将iPSCs引导为UMNs或VENs的方案。现有研究使用通用谷氨酸能神经元，通过小分子驱动分化或过表达神经发生素2（Neurogenin2）来实现。使用后一种方法的研究表明ALS神经元表现出基因表达和剪接的失调，影响细胞骨架重塑和突触功能，以及电生理改变。
4. 超越运动神经元：ALS作为一种多细胞疾病
早期在突变SOD1 ALS小鼠模型中的研究表明，表达突变SOD1的非神经元细胞能够损伤野生型运动神经元，而正常的非神经元细胞可显著延缓突变SOD1表达运动神经元的变性。这一发现将ALS的发病机制从细胞自主视角转向非细胞自主视角。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、功能最多样的胶质细胞群，执行多种稳态功能，包括细胞外钾离子缓冲、通过兴奋性氨基酸转运体1/2（EAAT1和EAAT2）清除谷氨酸、代谢供给、突触成熟和修剪、血脑屏障（BBB）维持、抗氧化防御和神经血管耦合。在病理条件下，静息星形胶质细胞发生形态、分子和功能改变而变为"反应性"，表现为细胞体增大、突起增厚和延长、分支复杂性增加，伴随胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增强。反应性星形胶质细胞逐渐丧失维持细胞外谷氨酸稳态的能力，表现为EAAT2表达降低，并显示K?缓冲改变、代谢耦合受损、Ca2?信号失调以及促炎细胞因子和活性氧（ROS）分泌增加。Nagai等人首次提供体外直接证据表明表达突变SOD1的星形胶质细胞具有神经毒性，且可溶性因子介导毒性作用。Haidet-Phillips等人从家族性和散发性ALS患者的死后脊髓中分离星形胶质细胞，证明星形胶质细胞介导的神经毒性可诱导健康运动神经元变性，与潜在遗传形式无关。
人iPSC衍生星形胶质细胞：填补动物模型与人类疾病之间空白的工具
与啮齿动物星形胶质细胞相比，人类星形胶质细胞更大、形态复杂性更高、接触的突触数量显著更多，并具有独特的转录特征和功能特性。人iPSCs允许从不同疾病阶段的活体患者生成星形胶质细胞，同时忠实保留致病突变和个体遗传修饰因子。携带TARDBP或VCP基因突变的患者来源iPSC衍生星形胶质细胞表现出增加的脆弱性。Fujimori等人建立了广泛的sALS体外模型，揭示了患者间的显著表型异质性，并开发了病例聚类系统。"Answer ALS"项目创建了约1000个来自ALS患者和健康对照的iPSC细胞系文库。共培养系统研究表明，携带C9orf72重复扩增的患者来源星形胶质细胞损害健康iPSC衍生运动神经元的电生理成熟并增加其脆弱性。FUS突变iPSC衍生星形胶质细胞被证明具有细胞毒性并削弱运动神经元与肌管建立功能性连接的能力。Dennys等人的研究证明CuATSM化合物能够减轻ALS患者来源星形胶质细胞对人运动神经元的毒性。
5. 增加模型复杂性：使用iPSCs的ALS类器官和器官芯片模型
5.1. 区域特异性类器官作为MNDs机制研究和药物发现的工具
皮层和脊髓类器官均可重现多种ALS相关表型，包括神经元成熟受损、电生理网络活动改变、反应性胶质增生和进行性运动神经元变性。大脑类器官在前3个月培养中的细胞分子指纹对应于发育第一孕期的原代细胞，而约3个月或更长时间的类器官则与第二孕期原代细胞的转录组匹配。脊髓类器官早期方案可生成多种脊髓细胞类型，包括表达ISL1、ChAT和FOXP1的运动神经元，但缺乏腰段身份标记。最近开发的改良方案可生成包含腰段身份细胞的类器官。ALS-C9orf72患者来源的皮层类器官揭示了ALS表型的早期功能障碍，包括神经元和星形胶质细胞中的DNA损伤和蛋白质稳态受损。SMA患者来源的腹侧脊髓类器官重现了该疾病典型的快速运动神经元变性。在ALS相关细胞系中，脊髓类器官鉴定出核骨架和细胞骨架连接体（LINC）复合物的改变。
5.2. 模型优化：类组装体（Assembloids）和器官芯片模型作为研究功能相互作用的工具
类组装体通过两个或多个类器官的融合生成，可重建不同神经区域之间的相互作用。皮层-运动类组装体结合皮层、脊髓和肌肉类器官以模拟完整的下行运动通路。类器官技术仍存在重要限制，包括成本高、可重复性和标准化挑战，以及缺乏功能性血管系统导致氧气和营养物质扩散受限。器官芯片系统将人干细胞衍生的神经群体整合到生物工程装置中，可重现组织架构，同时控制流体流动、生化梯度和机械刺激。在ALS背景下，已开发出人血脑屏障芯片，使用iPSC衍生脑微血管内皮样细胞、星形胶质细胞和神经元。Lall等人开发了名为脊髓芯片（SC-chip）的微流控装置来模拟sALS，结合了ALS患者iPSC衍生运动神经元与脑微血管内皮样细胞，揭示了神经丝表达的改变以及谷氨酸能和突触信号传导的失调。单核RNA测序鉴定出两个不同的运动神经元亚群，一个以MNX1表达为特征（骨骼运动神经元身份），另一个以PHOX2B表达为特征（颅运动神经元身份）。在微流控系统中，sALS患者iPSC衍生骨骼肌束与脊髓运动神经元整合，形成ALS运动单位芯片模型，雷帕霉素和博舒替尼联合治疗可部分恢复ALS条件下的肌肉收缩。
6. 结论与未来方向
早期体外研究主要聚焦于运动神经元，反映了ALS纯粹是细胞自主疾病的观点。随着星形胶质细胞和其他胶质细胞群对疾病进展关键贡献的证据出现，实验模型逐渐纳入这些额外细胞成分，首先发展为2D共培养系统，随后发展为更复杂的3D模型。iPSC衍生单培养物对于在高度受控条件下解析细胞自主机制不可或缺，共培养系统允许研究运动神经元与胶质细胞之间的双向串扰，类器官引入了结构组织和多细胞架构的额外层次，器官芯片平台则结合了这些优势与对流体动力学、生化梯度和机械刺激的精确控制。使用iPSC衍生运动神经元已导致治疗候选药物的鉴定：抗癫痫药物瑞替加滨（retigabine）被证明可减少家族性ALS细胞模型中的脊髓运动神经元过度兴奋和变性；罗匹尼罗（ropinirole）在ALS的1/2a期临床试验中显示出有前景的安全性和延缓运动功能衰退的能力；博舒替尼（bosutinib）在1期临床试验中显示出可接受的安全性，2期试验已注册。一个复杂的表型表征平台首次重现了ALS的关键特征，包括疾病进展和利鲁唑反应的患者相关变异性，并鉴定出包含利鲁唑在内的具有协同神经保护作用的药物组合。当前模型仍未能完全重现成人脊髓的若干关键特征，包括血管化、长期衰老、全身免疫相互作用和细胞异质性。自动化系统和人工智能工具的实施将加速这些步骤，使iPSC衍生模型充分发挥其潜力。
