意大利湖泊微塑料圈（plastisphere）与浮游群落中抗生素抗性基因（ARGs）及潜在致病类群的分布与功能预测

《Microplastics》：Plastisphere and Planktonic Communities in Italian Lakes: Distribution of Antibiotic Resistance Genes and Potential Pathogenic Taxa

　　

微塑料相关生物膜（plastisphere）已被提出作为抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）、潜在病原体和机会性微生物的潜在储库。然而，关于淡水生态系统的信息仍然有限。在本研究中，研究人员调查了四个意大利湖泊的微塑料圈（plastisphere）和浮游群落中选定ARGs的发生与分布、预测的抗性相关功能谱以及潜在致病细菌类群。采用定量PCR（quantitative PCR, qPCR）定量四种ARGs（bla_CTX-M、tetA、sul2和ermB），同时分析16S rRNA基因数据集以识别潜在致病细菌属并重建预测的抗性相关功能谱。与周围水体相比，ARGs在微塑料圈中检测更频繁且相对丰度更高，尽管其分布在湖泊和采样点之间高度异质。特别是，bla_CTX-M在微塑料（microplastics, MPs）上频繁检出，但在浮游群落中仅罕见检出。预测的抗性相关功能谱显示微塑料圈与浮游群落之间明显分离，MP相关生物膜的特征是抗性和应激相关功能贡献更高。在MPs上未观察到潜在致病细菌属的一致富集。总体而言，淡水微塑料圈群落可能代表独特的微生物微生境，其中ARGs和抗性相关功能比周围水体更频繁地积累，尽管局部生态条件似乎强烈影响其分布。

论文解读：意大利湖泊微塑料圈与浮游群落中抗生素抗性基因及潜在致病类群的分布与功能预测

微塑料（microplastics, MPs）通常定义为小于五毫米的塑料颗粒，由聚合物及添加剂和其他化学物质组成，是包括淡水系统在内的水生环境中广泛分布的污染物。MPs来源包括纺织品、化妆品、较大塑料碎片破碎、废水排放和城市径流等。其广泛存在及在不同生物水平上的效应引发了对其在水生环境中存在和潜在生态影响的关注。过去二十年，关于MPs分布、组成和生态效应的知识已显著增加，但其作为微生物污染潜在载体的作用仍了解不足。MPs进入水生环境后可提供稳定持久基质，促进微生物定殖，形成被称为“微塑料圈”（plastisphere）的塑料相关生物膜。该生物膜群落可能与周围水体中的微生物群落在组成和结构上不同。已有研究报道MPs和塑料表面存在机会性和潜在致病细菌，包括Pseudomonas、Legionella、Klebsiella、Aeromonas和Mycobacterium等；微塑料圈也被提出是水平基因转移的潜在环境，涉及抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）和可移动遗传元件交换。然而，与周围浮游群落相比，MP相关生物膜在多大程度上促进ARG富集仍未充分解决。部分淡水微塑料圈研究报告MPs与自然基质间ARG丰度和组成差异有限，另一些则发现MPs是ARG潜在储库，尤其在受人类影响系统或存在共选择压力时。这种变异性表明微塑料圈与微生物相互作用强烈受环境背景和污染水平影响，形成异质和位点依赖模式，在淡水生态系统中数据仍有限。大多数微塑料圈研究集中在海洋环境，湖泊系统研究较少，而湖泊提供饮用水、灌溉、工业用水和娱乐等重要服务。基于此前在意大利不同湖泊MPs上发现intI1基因和形成生物膜的机会性病原体如Legionella spp.、Pseudomonas aeruginosa和Salmonella spp.，本研究扩展了淡水微塑料圈ARG发生数据。研究人员在四个意大利湖泊中调查MP相关生物膜与周围浮游微生物群落中选定ARGs的发生、多样性和相对丰度，结合定量PCR（quantitative PCR, qPCR）和16S rRNA基因扩增子测序，量化ARGs，研究机会性和潜在致病细菌类群分布，并重建不同聚合物组成MPs的推断抗性组。

技术方法简述：样本来自四个意大利湖泊（Lake Maggiore、Lake Como、Lake Iseo和Lake Paola），于2019年7月“Goletta dei Laghi”监测活动（由Legambiente组织）采集；MPs用manta trawl采集，水样过滤于0.2 μm聚碳酸酯膜。DNA提取和16S rRNA基因高通量测序数据来自同一采样活动的已有研究，选取29个MP样本和9个水样。qPCR定量bla_CTX-M、tetA、sul2和ermB，以16S rRNA基因拷贝归一化。16S rRNA基因扩增子数据用于鉴定潜在致病细菌属，并用PICRUSt2预测KEGG Orthology（KO）功能谱，再以综合抗生素抗性数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD）筛选抗性相关功能。统计在R中进行，包括Mann–Whitney U检验、Brunner–Munzel检验、Kruskal–Wallis检验、Dunn事后检验、非度量多维尺度（NMDS）、PERMANOVA、冗余分析（RDA）和典范对应分析（CCA）等。

研究结果：

3.1 微塑料圈与浮游群落中的ARGs。通过qPCR分析29个MP和9个水样，ARGs在MP相关生物膜中相对丰度高于周围浮游群落（Mann–Whitney检验，p < 0.01），但分布高度异质和位点依赖。所有MP样本中均检出ARGs，bla_CTX-M检出频率为0.66，sul2为0.90；水样中sul2为33%，bla_CTX-M和tetA各为11%。总ARG相对丰度在MPs中约10^?3至6.4 GC/16S rRNA基因拷贝；水样为10^?4至10^?3 GC/16S rRNA基因拷贝。bla_CTX-M在66% MP样本中检出，Lake Maggiore出现热点，水样中罕见。sul2在MPs和水样中最常检出，水中相对较高；tetA在Lake Paola MPs中最高，达1.3 GC/16S rRNA基因拷贝，湖间差异显著（Kruskal–Wallis检验，p < 0.01）。ermB在Lake Como和Lake Paola MPs中最高分别达0.9和0.3 GC/16S rRNA基因拷贝，水中不可检出或低于10^?4。聚乙烯MPs常与较高ARG丰度相关，尤其tetA和sul2，但环境条件可能为主要驱动因素。

3.2 预测功能谱与推断抗性组。通过PICRUSt2从16S rRNA基因数据推断抗性组。浮游样本抗性组相对保守，总预测丰度为总reads的0.96%–1.35%，以外排系统为主，如抗性-结节-分裂（RND）转运子acrB/mexB/mtrD同源物和主要协助转运蛋白超家族（MFS）的mdtK、emrB、bcr，以及marR、CRP和baeS/baeR等调控和应激相关功能。微塑料圈功能谱不同，外排相关功能、膜转运系统、水平基因转移和应激反应基因贡献更高。NMDS和PERMANOVA显示浮游与MP相关群落显著分离（p < 0.01），MP样本分散度更高；按湖泊来源聚类显著（p < 0.01），按聚合物类型无一致聚类。预测功能谱应解释为潜在抗性相关功能差异，而非ARG表达直接证据。

3.3 微塑料圈与浮游群落中的潜在致病类群。通过16S rRNA基因测序，潜在致病属在所有样本中相对丰度低，群落主要由环境和机会性类群组成。未发现浮游与MP相关群落间潜在致病属总相对丰度显著差异。组成存在差异：Burkholderia、Flectobacillus和Paracoccus更常与MP相关；Bacteroides和Clostridium sensu stricto主要与浮游样本相关；Pseudomonas、Legionella、Aeromonas、Mycobacterium、Acinetobacter、Staphylococcus和Vibrio在两者中均低丰度检出。属水平分辨率不能区分环境与临床相关菌株，也不能推断毒力或感染性。

3.4 潜在病原体与推断抗性组的关系。通过RDA和CCA，潜在病原体与推断抗性组显著相关（总体模型p < 0.01），前两约束轴分别解释33.6%和31.0%的约束方差。样本按湖泊来源聚类。Lake Maggiore样本与Burkholderia和较少Acinetobacter相关，Lake Paola与Paracoccus相关；Roseomonas、Bacteroides、Clostridium sensu stricto、Flectobacillus和Sphingomonas等与不同湖系统相关。Burkholderia、Flectobacillus、Roseomonas和Paracoccus对观察到的抗性组模式贡献最强（RDA置换检验，p < 0.05）。这些模式表明湖间推断抗性组差异更与微生物群落结构变化有关，而非单一潜在致病类群的出现。

讨论部分总结：讨论指出，微塑料圈可支持微生物持久存在和扩散，但未支持MPs上存在独特或一致富集的致病集合。局部生态条件可能比聚合物类型更强影响微塑料圈组成和功能。先前长期淡水研究提示机会性类群可在生物膜发育过程中持续存在，但其相对丰度在生物膜成熟后期趋于下降。总体而言，微塑料圈的生态相关性可能更多与结构化生物膜中微生物的持久和扩散有关，而非选择性富集致病类群。

研究结论翻译：MP相关生物膜的特征是ARG丰度高于相应的浮游群落，表明微塑料圈可能是ARG持久存在和局部积累的有利微生境。此外，预测的抗性相关功能谱在MP相关群落和浮游群落之间不同，表明与微塑料圈相关的独特抗性相关功能模式。相反，未观察到MPs上潜在致病细菌属一致富集的证据，尽管在湖泊之间和生境之间检测到分类组成的差异。在所有分析中，湖泊和采样点之间的显著变异性成为反复出现的特征，突出局部生态条件在塑造ARG分布和推断抗性组中的重要性，而聚合物相关效应似乎有限。尽管微塑料圈研究日益超越描述性方法，转向更好理解微生物定殖和抗性传播的功能和机制过程，但淡水生态系统中ARG发生和分布的稳健信息仍然是支持这些发展所必需的。在此背景下，本研究有助于扩展湖泊相关微塑料圈群落中ARG发生的可用数据集，并为未来研究MP相关生物膜的生态作用提供数据驱动的基础。