多组学与分子对接整合分析植物乳植杆菌S4在沙棘汁发酵中的苹果酸降解优势

《Foods》：Integrated Multi-Omics and Molecular Docking Analysis of Malate Degradation by Lactiplantibacillus plantarum S4 During Sea Buckthorn Juice Fermentation

　　

沙棘汁（Sea buckthorn juice, SBJ）具有营养价值，但其高苹果酸含量导致过强酸味，限制消费者接受度。本研究比较了两株乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）分离株——植物乳植杆菌S4（Lactiplantibacillus plantarum S4）和副干酪乳酪杆菌YJ2（Lacticaseibacillus paracasei YJ2）——的降酸表型，采用发酵表型分析、感官评价、酶活力测定、非靶向代谢组学、转录组学和分子对接。发酵96 h后，S4降解了91.98%的苹果酸，而YJ2为69.50%，并在受试条件下表现出更高的活菌计数和总体感官可接受性。S4在有利于苹果酸乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）的条件下也表现出更高的粗提物苹果酸转化活性。分子对接预测，苹果酸与S4来源的MleP和MleS的相互作用比与YJ2相应蛋白更有利；然而，这些分析并未直接测量MleP介导的转运或MleS特异性催化通量。代谢组学分析显示，S4发酵的SBJ中苹果酸和若干其他有机酸丰度较低，同时琥珀酸、2-酮戊二酸（2-oxoglutaric acid）、苯乳酸相关代谢物、D-章鱼碱（D-octopine）和N-乳酸酰苯丙氨酸（N-lactoyl-phenylalanine）丰度增加。转录组分析揭示S4与YJ2在碳水化合物代谢、糖酵解、丙酮酸代谢、能量生成和后期细胞维持方面存在差异。这些数据集的整合支持一个工作模型，其中苹果酸相关转化、中心碳再分配、有机酸重塑和酸胁迫适应可能促进S4更强的苹果酸去除表型。由于每种仅检测了一个分离株，观察到的差异应解释为S4与YJ2之间的差异，而非物种水平效应。

研究背景：沙棘（Hippophae rhamnoides L.）富含抗坏血酸、类胡萝卜素、类黄酮、多酚、有机酸、植物甾醇和功能性脂肪酸，是功能食品和植物基饮料的重要资源。但原SBJ总酸高、pH低，导致尖酸、涩感和感官刺激，限制直接消费和商业应用；L-苹果酸是强酸感知的主要贡献者。LAB发酵是温和生物加工策略，可改善果蔬汁酸度、口感、营养和贮藏稳定性。苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）是关键降酸途径，一般由MLE催化，将二羧酸L-苹果酸脱羧为单羧酸L-乳酸并释放CO₂。但苹果酸降解并非单步反应，可能涉及苹果酸转运、MLE脱羧、丙酮酸形成、乳酸脱氢酶调节、柠檬酸代谢协调以及二羧酸和三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）相关节点重塑。苹果酸酶（malic enzyme, MAE）相关苹果酸-丙酮酸途径和苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）相关苹果酸-草酰乙酸途径可能辅助碳流重分配。LAB苹果酸降解效率高度菌株依赖，现有酸胁迫适应机制不能完全解释SBJ中菌株差异。因此，研究人员比较S4和YJ2在相同高酸SBJ发酵条件下的苹果酸降解表型，并识别相关生化和分子特征，以生成整合工作模型。

关键技术方法：SBJ由新疆源麦贸易有限公司（Aksu, China）提供。Lactiplantibacillus plantarum S4保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC No. 37352；Lacticaseibacillus paracasei YJ2为实验室保藏。研究人员将SBJ稀释、补充6%葡萄糖、巴氏杀菌后，以2%活化菌悬液在35 °C厌氧发酵96 h，在0、24、48、72、96 h取样。关键技术包括发酵表型与感官评价、粗提物酶活测定（MLE偏好条件苹果酸转化、MAE、MDH）、非靶向LC–MS/MS代谢组学、转录组测序、同源建模与分子对接。

研究结果：
3.1 发酵性能、苹果酸降解及SBJ发酵过程中感官变化。通过发酵表型和感官评价，两组初始苹果酸约3.9 g/L，S4组苹果酸下降快于YJ2，尤其24–48 h；96 h时S4残苹果酸约0.31 g/L，YJ2约1.19 g/L，S4降解率91.98%，YJ2为69.50%。S4 pH在前48 h快速升高并在48 h达最大，YJ2升高较慢且峰值延迟；总酸早期下降、后期回升，S4最终总酸高于YJ2但残苹果酸更低。48 h后S4活菌数显著高于YJ2，96 h达9.1 log CFU/mL；两组°Brix无显著差异。感官评价中三组颜色和香气相似，但酸度、涩味、甜度和总体可接受性不同；S4发酵SBJ总体可接受性最高。结论是S4具有更好的苹果酸降解效率、生长性能、酸谱调节和感官可接受性。

3.2 酶活性及苹果酸相关蛋白比较对接。通过粗提物酶活和分子对接，48 h时S4粗提物在MLE偏好条件下苹果酸转化活性显著高于YJ2；该法使用无细胞粗提物，不测MleP膜转运，净苹果酸消失可反映多个酶，因此解释为表观MLE相关苹果酸转化活性。单独测定的MAE和MDH活性在S4中低于YJ2，提示这两个分支本身不太可能解释S4更强苹果酸消耗。S4-MleP与苹果酸结合能低于YJ2-MleP，S4-MleS也低于YJ2-MleS，代表构象中苹果酸更深嵌入S4-MleP和S4-MleS预测结合口袋；但此结果仅支持底物识别差异，不证明转运速率或催化效率。MAE结合能相似，YJ2-MDH对苹果酸结合倾向略强。结果与MleP–MleS途径对S4更快苹果酸去除的贡献一致，但MleP转运能力仍需实验验证。

3.3 非靶向代谢组学揭示苹果酸消耗和代谢重分配。通过LC–MS/MS非靶向代谢组学，偏最小二乘判别分析（partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA）清楚分离未接种对照B1、S4和YJ2组，模型R²X(cum)=0.589、R²Y(cum)=0.967、Q²(cum)=0.903，200次置换检验显示无过拟合证据。与YJ2相比，S4中苹果酸相关代谢物丰度显著降低，柠檬酸、异柠檬酸相关信号和富马酸也降低；琥珀酸、2-酮戊二酸、D-3-苯乳酸、羟基苯乳酸、D-章鱼碱和N-乳酸酰苯丙氨酸增加。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集显示差异代谢物主要关联中心碳代谢、TCA相关途径、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及氨基酸代谢。相关分析显示高酸有机酸模块与发酵产物相关模块相反。结论是S4发酵伴随有机酸及相关代谢谱广泛重塑，但不能确定苹果酸直接碳流进入积累产物。

3.4 转录组分析揭示苹果酸利用和细胞适应的不同时间策略。通过转录组测序，主成分分析（principal component analysis, PCA）清楚分离四组，PC1和PC2分别解释86.62%和6.62%总方差。48 h时S4较YJ2有298个基因高表达、2385个低表达；96 h降至72个高表达和1323个低表达。48 h S4高表达基因富集于翻译、核糖体组织、RNA结合、大分子生物合成、RNA聚合酶活性、氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢、糖酵解/糖异生和核苷酸代谢；磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS）相关基因pts9AB和pts9C分别log₂FC为5.351和6.241，fba、gpmA2、pgk、pyk、pdhA、atpE、rpoB、secY较高。mleP、mleS、mae、citP、fum和pycA在S4两个取样点均较低，但不能据此认为S4苹果酸利用弱，因为表型显示S4更快消耗苹果酸，粗提物活性更高，对接提示MleP和MleS识别环境差异；转录本丰度不能直接推断通量。96 h时S4转向细胞维持，pts9AB和pts9C低表达，gpmA2、atpE、rpoB、rpoC、dnaK和hrcA保持中度升高；clpB、prsA2、dltB和gadB在S4中显著低于YJ2。结论是S4早期偏好碳水化合物同化和中心碳代谢，后期维持翻译能力、能量稳态和蛋白稳态，而YJ2保留更广泛的晚期分解和胁迫响应程序。

讨论部分总结：研究人员整合发酵表型、分子对接、代谢组和转录组数据，提出阶段依赖工作模型。早期快速降酸阶段，模型将MleP置于苹果酸转运蛋白位置，将MleS置于苹果酸乳酸酶位置，将胞内L-苹果酸转化为L-乳酸和CO₂；S4粗提物在MLE偏好条件下活性更高，比较对接提示S4与YJ2来源MleP和MleS对苹果酸识别可能不同，但对接不能测转运动力学或催化周转，因此仅为支持性证据。同时PTS依赖性碳水化合物摄取增强，糖酵解能力增加，丙酮酸转化、ATP合成、转录能力和蛋白输出相关基因上调，代谢组显示TCA相关和二羧酸相关代谢广泛重塑。96 h时S4转向细胞维持，持续表达gpmA2、atpE、rpoB/rpoC、dnaK和hrcA，与91.98%苹果酸减少、pH升高、酸涩降低、总体可接受性提高和活菌数更高一致。整体支持MleP–MleS介导苹果酸转化、中心碳再分配、有机酸重塑、风味代谢物形成和晚期稳态维持共同贡献S4优越降酸性能的模型，但MleP相对转运能力仍是推断。

研究结论翻译：在本研究对两株LAB分离株的比较中，Lactiplantibacillus plantarum S4在96 h内从SBJ中去除91.98%的苹果酸，而Lacticaseibacillus paracasei YJ2为69.50%，并在受试条件下表现出更高的活菌计数和总体感官可接受性。这些结果证明S4与YJ2之间存在明显表型差异，但由于每种仅检测了一个分离株，不能区分物种水平效应与分离株特异性特征，也不应推广至L. plantarum和L. paracasei物种。整合的酶、分子对接、代谢组学和转录组学数据与MleP–MleS相关苹果酸转化系统对S4更强苹果酸去除表型的贡献一致。然而，MleP介导的转运、MleS特异性催化活性和化学计量学乳酸生成未被直接定量；因此，该途径的相对贡献和通量仍属推断。S4更强的苹果酸消耗还伴随中心碳代谢、有机酸重塑、发酵相关代谢物谱和后期细胞维持的差异。这些观察支持所提出的工作模型，将苹果酸相关转化与更广泛的代谢和胁迫适应反应联系起来，而不是建立明确因果机制。总体而言，结果确定S4是进一步开发为SBJ发酵剂的有前景候选者。需要在更广泛的L. plantarum、L. paracasei和其他LAB菌株集合中进行验证，并结合苹果酸转运、酶特异性活性和乳酸生成的直接测量，以确定所观察表型的普遍性和因果基础。