小麦表面微生物群作为高温大曲品质的关键驱动因素：基于微生物多样性与挥发性风味分析的证据

《Foods》：Wheat-Surface Microbiota as a Key Driver of Daqu Quality: Evidence from Microbial Diversity and Volatile Flavor Analysis

　　

传统发酵过程依赖复杂微生物群落；然而，原料相关微生物对群落组装和风味形成的具体贡献仍不清楚。本研究以传统大曲（T）和表面消毒大曲（S）作为配对对照，以解耦原料相关微生物的贡献。通过整合群落、风味和功能分析，研究人员揭示了其在驱动确定性组装、重塑真菌互作以及与特征风味关联中的生态作用。结果表明，T以糖多孢菌（Saccharopolyspora）和热子囊菌（Thermoascus）为主，而S以魏斯氏菌（Weissella）等中温乳酸菌为主。小麦相关微生物施加的选择压力驱动确定性群落组装，并使真菌互作从竞争转向正互惠。共鉴定出110种风味化合物，从中筛选出21种潜在贡献化合物和25种差异标志物。T的特征风味为四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine）、二甲基三硫醚（dimethyl trisulfide）、苯甲醛（benzaldehyde）、异戊酸（isovaleric acid）和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（2-methoxy-4-vinylphenol），而S的特征风味主要为1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）、2-辛酮（2-octanone）和苯乙醇（phenylethyl alcohol）。功能预测和相关性分析显示，小麦相关微生物与淀粉酶（amylase）和乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）等初级代谢途径正相关，而糖多孢菌（Saccharopolyspora）、Cutaneotrichosporon和特定芽孢杆菌（Bacillus）物种与次级代谢及特征风味形成正相关。本研究加深了对原料相关微生物生态作用的理解，并为传统发酵食品的工艺优化和微生物群落调控提供了科学依据。

该研究围绕高温大曲（high-temperature Daqu）发酵中小麦表面微生物群（wheat-surface microbiota）的生态作用展开。传统发酵依赖复杂微生物群落，但原料相关微生物对群落组装和风味形成的具体贡献不清。已有研究多依赖来源追踪或相关性分析，难以区分小麦相关微生物与周围环境微生物的贡献；高温阶段对中温营养细胞和非耐热真菌形成强选择压力，小麦携带微生物可能是早期群落重要来源。因此，研究人员用未处理小麦和表面消毒小麦建立T与S配对高温大曲发酵体系，通过受控比较解耦原料相关微生物贡献，评估其对细菌、真菌演替、群落组装、挥发性风味及特征风味化合物的影响，旨在为从自然接种走向精准微生物调控提供依据。该研究得出：T以Saccharopolyspora和Thermoascus为特征，S保留更多乳酸菌及较广霉菌和酵母；T中后期确定性选择更强，尤其真菌；两处理挥发性风味谱不同，T富集四甲基吡嗪、二甲基三硫醚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚等，S富集1-辛烯-3-醇、2-辛酮等。其意义在于深化原料微生物群生态角色理解，为原料预处理、关键功能微生物定向补充、强化曲开发及大曲工艺优化提供基础。

关键技术方法：小麦样品来自贵州唐庄中国酒业有限公司（Guizhou Tangzhuang Chinese Liquor Limited company, Zunyi, China）。研究人员将小麦分为未处理T组和表面消毒S组，在相同高温大曲条件下独立发酵40天，于0、10、20、40天采样，每组每时间点4个重复，共32个代表性样品。关键技术包括：16S rRNA V3–V4和ITS1扩增子测序分析细菌、真菌群落；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析挥发性风味；相对气味活度值（ROAV）筛选潜在香气贡献物；生态位宽度、Sloan中性群落模型和标准化随机性比率（NST）评估群落组装；共现网络分析微生物互作；PICRUSt2功能预测和Pearson相关分析微生物-风味关联。

研究结果如下。3.1 微生物多样性：通过稀疏曲线、PCA和alpha多样性分析，T细菌多样性0至10天增加后下降，S总体增加至40天；真菌S在0天高于T，20天两组明显下降，40天略恢复。PCA显示T与S细菌、真菌群落明显分离，早期变化大，中后期聚类增强，真菌在20和40天更紧密。结论是减少小麦相关微生物改变大曲微生物组成与演替轨迹，环境过滤中后期更重要。3.2 核心微生物组成与差异类群：通过门、属水平组成和随机森林分析，0天Bacteroidota和Proteobacteria合计超过80%，10天后Firmicutes增加；中后期T中Actinobacteriota增加并占优，S中Firmicutes仍占优。属水平T富集Kroppenstedtia、Oceanobacillus，随后Saccharopolyspora占优，20天为36.21%，40天为53.52%；S富集Weissella、Pediococcus等乳酸菌。真菌中Ascomycota全程超过93%；T富集Microascus、Thermoascus，20天Thermoascus达92.31%，40天Thermoascus和Thermomyces共优；S保留Aspergillus、Saccharomycopsis等。随机森林显示T特征为Saccharopolyspora、Actinopolyspora、Caldibacillus，S特征为Weissella、Staphylococcus、Pediococcus；真菌T特征为Thermoascus，S特征为Rasamsonia、Saccharomycopsis、Thermomyces、Aspergillus。结论是初始小麦相关微生物影响后续细菌演替，T富集耐热放线菌，S保留乳酸菌和更广真菌。3.3 微生物生态位分析：通过生态位宽度、Sloan中性模型和NST，细菌T生态位宽度0至20天稳定，40天下降；S波动。模型R²总体为0.575，T为0.356，S为0.491，Nm分别为139、178、318。NST在T仅10天大于0.5，0、20、40天小于0.5；S在0和40天大于0.5，10和20天小于0.5。真菌生态位宽度中后期两组下降；模型R²总体为0.320，T为0.223，S为0.281，Nm分别为18、12、104；NST在T的20和40天接近0，S的10和20天小于0.5。结论是细菌组装阶段依赖，T中后期确定性更突出；真菌中后期确定性更强，T尤其明显，与耐热真菌富集一致；该分析不能区分温度、水分和酸度的具体贡献，确定性组装不等于品质更好。3.4 挥发性风味化合物。3.4.1 挥发性风味谱与潜在贡献化合物：通过GC-MS鉴定110种化合物，包括29种酯、19种醇、6种酸、13种醛、9种酮、13种吡嗪、4种酚、8种苯系物、3种呋喃和6种其他代谢物。PCA中PC1和PC2分别解释33.26%和19.06%，T与S轨迹不同。ROAV≥1筛选出21种潜在香气贡献物。T在10至20天富集醛、酚和硫化物，苯甲醛和苯乙醛在10天ROAV分别达90.35和39.03；愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚和二甲基三硫醚中后期贡献高，构成焙烤、酱香和甜花香复合风味。S关键香气不同，1-辛烯-3-醇具蘑菇和泥土味，ROAV高达100，2-壬酮贡献果香和花香，赋予真菌样细腻香气。结论是两微生态系统底物代谢途径不同，T酚类和吡嗪富集与耐热放线菌、真菌的木质素和阿魏酸降解能力及高温微环境一致；S保留多样霉菌和酵母，促进真菌相关风味积累。3.4.2 差异风味化合物筛选：通过PLS-DA，模型R²X(cum)=0.878，R²Y(cum)=0.662，Q²(cum)=0.51，200次置换无过拟合。以VIP>1且p<0.05筛选25种差异标志物。第一类为T持续富集物，主要为四甲基吡嗪、三甲基吡嗪等吡嗪，以及3-甲基丁酸和苯乙醛；第二类为T阶段响应物，如糠醛在10天积累后降解、乳酸乙酯富集；第三类为S特异富集物，如2-辛酮、苯乙醇和1-辛烯-3-醇。结论是差异标志物反映不同微环境和代谢途径；T吡嗪和呋喃与高温美拉德反应相关，异戊酸和苯乙醛可分别来自支链和芳香氨基酸分解；S标志物与真菌和酵母代谢相关，1-辛烯-3-醇由脂氧合酶介导亚油酸氧化，苯乙醇为酵母苯丙氨酸代谢产物。3.5 微生物群落互作模式：通过共现网络分析，T细菌网络模块化指数为0.45，含81个组件；S更连通，聚类系数0.82，自然连通度0.17，模块化指数0.33，含20个组件。T在0天高度碎片化，平均52.5个组件，40天降至15.75且密度增加；S全程高度连接，约3个组件。Zi-Pi分析显示T多数为外周节点，S含更多模块枢纽。真菌网络正边比例低于细菌；T后期更简单，主要为正关联；S保留更多真菌类群和更高负关联比例。T正边比例在10至20天达93.36%并保持较高，S为65.17%至84.38%。结论是两处理群落组织不同，T更整合且模块化高，S更密集连接；T真菌正关联增加与真菌群落简化及耐热真菌富集一致，可能反映相似环境响应而非直接合作。3.6 功能预测与相关分析：通过PICRUSt2和Pearson相关分析，两组均富集碳水化合物代谢功能。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）时间斜率为负，葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.3）为正。酒精脱氢酶（EC 1.1.1.1）在T总体增加，S无显著线性趋势；乙酰乳酸合酶（EC 2.2.1.6）在T为正，S不显著；羧酸酯酶（EC 3.1.1.1）和甘油三酯脂肪酶（EC 3.1.1.3）两组为正但非线性。芳香族L-氨基酸脱羧酶（EC 4.1.1.28）和单胺氧化酶（EC 1.4.3.4）两组显著为正但非线性；catechol O-methyltransferase（EC 2.1.1.6）因非零样本比例不足被排除。相关分析显示，T中Saccharopolyspora和Actinopolyspora与二甲基三硫醚及吡嗪正相关，Cutaneotrichosporon与2-甲氧基-4-乙烯基苯酚正相关，Bacillus与3-甲基丁酸强正相关；S中Weissella、Pediococcus和Bacillus与乙酸和2,3-丁二醇正相关，Thermomyces与苯乙酸甲酯、四甲基吡嗪等酯和杂环化合物正相关。结论是两组初级碳水化合物代谢潜力冗余，但与特征次级代谢物的关联不同，与微生物演替和挥发谱差异一致；功能预测为探索性，不应视为功能基因丰度、酶表达或酶活性的直接测量。

讨论部分总结：该研究以受控比较证明小麦相关微生物影响高温大曲群落组装、真菌互作和特征风味形成。传统大曲中Saccharopolyspora和Thermoascus富集，表面消毒组中乳酸菌、霉菌和酵母更持久；中后期确定性选择增强，尤其真菌；风味差异与耐热放线菌、真菌的高温代谢及真菌、酵母代谢相关。但确定性组装不等于品质更优，且温度、水分、酸度贡献未能区分；功能预测仅为探索性，需进一步验证。研究结论部分翻译：本研究评价了小麦相关微生物对高温大曲发酵过程中微生物演替、群落组装和挥发性风味形成的贡献。传统大曲（T）形成了以糖多孢菌（Saccharopolyspora）和热子囊菌（Thermoascus）为特征的群落，而灭菌小麦（sterilized-wheat，S）组保留较高丰度的乳酸菌和更广泛的霉菌与酵母。群落组装分析表明，传统大曲发酵中后期确定性选择贡献更强，尤其对真菌。两种处理也形成不同挥发性风味谱。传统大曲以四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine）、二甲基三硫醚（dimethyl trisulfide）和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（2-methoxy-4-vinylphenol）较高贡献为特征，而1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）和2-辛酮（2-octanone）更典型于灭菌小麦组。尽管功能预测提示初级碳水化合物代谢存在显著冗余，微生物组成与特征性次级代谢物存在差异关联。总的来说，这些结果表明初始小麦相关微生物群对高温大曲发酵中微生物演替和风味发育有实质贡献。这些发现为进一步研究原料微生物群及其在提高大曲生产一致性和质量中的潜在应用提供了基础。未来可分离筛选关键功能微生物，开发定向补充或强化曲，结合工艺调控构建可控初始群落，从而稳定发酵过程和风味，促进标准化生产应用。然而，本研究仅为探索性相关分析，未整合微生物群落、PICRUSt2预测功能和挥发性风味谱；预测功能不是独立测量，结论仍需宏转录组学、宏蛋白质组学或靶向代谢组学验证。