基于PGE2与LTB4双重调控的Ocotea diospyrifolia内生真菌天然产物去重复化研究及其抗炎潜力

《Molecules》：Dereplication of Natural Products from an Endophytic Fungus from Ocotea diospyrifolia with Anti-Inflammatory Potential Through Dual Modulation of PGE2 and LTB4 Release

内生真菌是结构多样的天然产物的重要来源，具有广阔的药理和生物学应用前景。本研究以从Ocotea diospyrifolia叶片中分离的内生真菌为对象，采用整合生物学筛选、比较代谢组学和高分辨质谱去重复化的工作流程，考察其作为抗炎天然产物潜在产生菌的可能性。研究人员对五株内生真菌（编号为OD1、OD5、OD6、OD7和OD8）的粗提物进行了抑制前列腺素E2（PGE2）和白三烯B4（LTB4）释放的活性筛选。其中，Lentinus sp. OD5提取物显示出显著的双重抑制活性，基于UHPLC-QTOF-HRMS的代谢组学分析注释出两个化合物。质谱数据分析结合SIRIUS注释，初步鉴定出杜鹃素（rhodojaponin，一种具有报道抗炎活性的木藜芦烷型二萜）和丁哥王苷（tinocordiside，一种免疫调节二萜糖苷）。上述发现拓展了目前与内生真菌相关的化学多样性，并为未来抗炎代谢产物的分离、结构确证及药理学评价奠定了坚实基础，具有潜在的治疗应用价值。

论文解读文章

一、研究背景与问题

炎症是机体应对有害刺激的重要防御机制，在组织修复和宿主保护中发挥关键作用。然而，当炎症失调或持续存在时，可促进多种病理状态的发生与发展，包括骨关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病、心血管疾病及肥胖等。炎症的发生和进展主要由花生四烯酸经环氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径生成的脂质介质过量产生所驱动。COX酶包括COX-1和COX-2两种亚型，催化前列腺素的生物合成；而LOX则负责白三烯及其他参与炎症反应的生物活性脂质介质的生成。

传统非甾体抗炎药（NSAID）通过非选择性抑制COX发挥治疗作用，但可导致胃肠道损伤，同时花生四烯酸代谢向LOX途径分流可能增加白三烯的产生，诱发过敏反应和支气管痉挛。选择性COX-2抑制剂（即“考昔类”药物）虽降低了胃肠道毒性，却与心血管不良事件风险增加相关。因此，亟需开发能够同时抑制前列腺素和白三烯生物合成的新型抗炎药物。双重COX/LOX抑制剂，特别是靶向COX和5-LOX的抑制剂，能够同时抑制关键促炎介质的产生，是开发更安全、更有效抗炎疗法的合理策略。除炎症性疾病外，双重COX/5-LOX抑制的概念在癌症及神经退行性疾病治疗中也日益受到关注。

天然产物是结构多样的生物活性分子最丰富的来源之一，已发现多种天然产物类别（如生物碱、黄酮类、萜类、环烯醚萜类和香豆素类）具有双重COX和LOX抑制活性。Ocotea属（樟科）包含约400个物种，其中许多原产于南美洲，长期以来因其广泛的药理潜力（尤其在风湿性疾病治疗方面）而受到研究。代谢组学和植物化学研究表明，Ocotea物种是抗炎化合物生物勘探的重要来源。O. odorifera和O. diospyrifolia的抗炎特性已有报道，包括鉴定出能够抑制前列腺素和/或白三烯的主要活性化合物。

内生真菌栖息于植物内部组织而不造成伤害，通常与宿主建立互利共生关系，促进植物生长并增强对生物和非生物胁迫的耐受性。具有明确药理特性的药用植物与其内生菌群落之间的关系在生物勘探视角下尤为引人关注。已有研究表明，具有良好药理特性的宿主植物是能够产生与宿主植物中结构相关甚至相同生物活性代谢物的微生物的储存库。内生真菌产生原本被认为仅存在于宿主植物中的特化代谢物的能力，可通过多种假说解释，包括长期植物-真菌互作过程中的水平基因转移、对共享环境信号的适应性响应（异源激素效应），以及在相似选择压力下相似生物合成途径的独立进化。尽管目前对Ocotea物种的化学和药理性质的兴趣日益增加，但对其相关内生真菌的抗炎潜力知之甚少，且将生物活性评估与这些微生物的综合代谢组学表征相结合的研究仍然有限。

二、研究内容与意义

本研究描述了从O. diospyrifolia分离的内生真菌提取物的抗炎潜力，并利用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）表征其化学特征。通过将生物学筛选与非靶向代谢物谱分析相结合，研究人员鉴定出具有前景的生物活性真菌提取物，并初步注释了与其化学特征相关的代谢物，为Ocotea相关内生真菌的化学多样性和抗炎潜力提供了新的见解。

三、关键技术方法

研究人员从O. diospyrifolia叶片中分离出五株内生真菌（OD1、OD5、OD6、OD7和OD8），在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中培养10天后用乙酸乙酯（EtOAc）提取代谢物。关键技术方法包括：（1）基于人全血的离体抗炎活性筛选，通过UHPLC-MS/MS定量检测PGE₂和LTB₄水平；（2）基于内转录间隔区（ITS）序列的系统发育分析进行菌株鉴定；（3）UHPLC-HRMS代谢组学分析及总离子流色谱图（TIC）比较；（4）MZmine特征检测与比对；（5）SIRIUS平台结合MS/MS数据的计算机辅助注释与人工碎裂途径解析。样本来源为2016年6月采集自巴西米纳斯吉拉斯州阿尔费纳斯大西洋森林区域的O. diospyrifolia叶片，植物凭证标本（UALF 2965）保存于阿尔费纳斯联邦大学标本馆。

四、研究结果

4.1 内生真菌提取物对PGE₂和LTB₄释放的双重调节筛选

通过离体人全血抗炎实验评估五株内生真菌提取物对PGE₂和LTB₄水平的抑制作用。结果显示，所有提取物均表现出显著的抗炎活性。其中OD5、OD6和OD8提取物显示出最强的抑制效果，显著降低了PGE₂水平（p < 0.05），而OD1和OD7提取物活性较低。在LTB₄水平方面，OD5、OD6和OD8提取物表现出最显著的降低效果，而OD1和OD7提取物无活性。总体而言，OD5、OD6和OD8提取物对促炎介质PGE₂和LTB₄的释放具有同步抑制作用。其中，OD5因同时抑制两种介质释放的突出能力及其独特的化学特征被选为进一步研究的对象。

4.2 内生真菌的比较代谢物谱分析

通过UHPLC-HRMS获取五株内生真菌EtOAc提取物的总离子流色谱图（TIC）并进行比较分析。视觉检查显示内生真菌间存在代谢变异。值得注意的是，OD5菌株在12.5至13.5分钟之间洗脱出一簇独特的代谢物，在其他内生真菌提取物中未观察到。这些独特的色谱特征表明OD5产生菌株特异性特化代谢物，可能与其良好的抗炎活性相关。

4.3 OD5的系统发育鉴定

基于ITS区域的系统发育分析支持OD5与密切相关分类群的亲缘关系。序列相似性搜索显示，OD5的ITS序列与GenBank数据库中Lentinus flexipes（原Polyporus tricholoma）的序列具有95-99%的一致性。OD5与L. flexipes分支连接的节点具有中等至较低的自举支持率（54%），而包含OD5和L. flexipes的更大分支具有强支持率（98%），确认其在Lentinus属内的密切系统发育亲缘关系。由于OD5-L. flexipes节点的自举值相对较低，无法支持物种水平的可靠鉴定，因此综合证据支持将菌株OD5鉴定为Lentinus sp.。

4.4 基于UHPLC-HRMS/MS的Lentinus sp. OD5特异性代谢物初步注释

MZmine特征检测和比对确认了Lentinus sp. OD5提取物中三个特征的存在，这些特征超过设定的检测阈值，在其他菌株中未观察到，在12.50至13.50分钟的窄色谱窗口内洗脱，包括两个同分异构离子m/z 419.2040（化合物1，RT 12.70和12.95分钟）和第三个化合物m/z 433.2197（化合物2，RT 13.16分钟）。

去重复化分析采用LC-MS/MS数据分析、SIRIUS平台计算分析及人工碎裂途径推导。两个色谱分离的代谢物具有相同的前体离子m/z 419.2040（[M+Na]⁺），表明存在同分异构化合物，两者产生基本相同的MS2谱。SIRIUS注释将这些化合物归属为丁哥王苷（tinocordiside，化合物1）和/或相关同分异构结构。化合物1的分子式为C₂₁H₃₂O₇，是一种重排杜松烷型倍半萜糖苷，最初从药用植物Tinospora cordifolia中分离获得。

对于m/z 433.2197的前体离子，质量精度极佳（Δ -0.46 ppm），SIRIUS预测的分子式为C₂₂H₃₄O₇，与二萜类化合物杜鹃素II（rhodojaponin II）或杜鹃素V（rhodojaponin V）匹配。SIRIUS将rhodojaponin II列为天然产物数据库中评分最高的候选物，但rhodojaponin V具有相同的分子式且立体化学不同，仅凭现有MS数据无法排除。化合物2是高度氧化的木藜芦烷型二萜，是从Rhododendron molle G. Don（杜鹃花科）根和叶中分离的最丰富的二萜之一。

五、讨论总结与结论翻译

讨论部分指出，离体生物活性筛选揭示了从O. diospyrifolia分离的五株内生真菌EtOAc提取物具有显著的抗炎潜力。不同提取物表现出的不同抑制特征表明其含有化学多样性的特化代谢物。OD5、OD6和OD8提取物对PGE₂和LTB₄水平的显著降低尤为相关，具有双重活性的天然产物已被研究为潜在的抗炎先导化合物。研究结果可能直接与炎症级联上游的COX酶相关，但确切的作用机制需要进一步评估。此外，未对内生真菌提取物进行细胞毒性评估，这是本研究的局限性之一。

系统发育分析将菌株OD5置于Lentinus谱系内，ITS相似性为95-99%，支持其归属于该属。Lentinus物种分布广泛，因其生态多样性和产生结构多样的特化代谢物的能力而受到广泛关注。OD5作为内生真菌从O. diospyrifolia获得而非从自由生活的子实体分离，这一点尤其有趣，因为内生定殖可能使真菌暴露于宿主相关的生态压力，从而影响特化代谢物的生物合成。

化学去重复化和数据库信息学的近期进展从根本上改变了生物活性天然产物的研究，加速了先导发现过程。TIC比较证实了五株内生真菌提取物化学特征的显著差异，Lentinus sp. OD5提取物在约12至14分钟之间显示出独特的色谱信号簇。MZmine特征检测和比对确认了三个仅在Lentinus sp. OD5提取物中检测到的分子特征。注释工作流程结合了精确前体质量分析、MS2碎裂、SIRIUS计算机模拟光谱解释和数据库交叉参考，以及碎裂归属的人工整理。

结论部分指出，整合的生物学和代谢组学工作流程成功地将内生真菌Lentinus sp. OD5确定为O. diospyrifolia分离物中具有前景的抗炎特化代谢物产生菌。Lentinus sp. OD5粗提物对PGE₂和LTB₄的释放表现出显著的双重抑制作用。对不同内生真菌提取物化学组成的比较分析使得从Lentinus sp. OD5中快速优先鉴定出两种代谢物，指导了后续抗炎天然产物的发现。高分辨串联质谱结合SIRIUS注释初步鉴定了这些代谢物为丁哥王苷和杜鹃素II/V。注释的真菌代谢物此前已被报道通过互补的作用机制具有抗炎活性。总体而言，该研究表明O. diospyrifolia的内生真菌是抗炎特化代谢物的有前景来源，值得进一步开展代谢物分离和完整波谱表征以及作用机制研究。