编辑推荐：
巴贝斯虫属（Babesia）是一类由蜱传播的顶复门寄生虫，具有广泛的医学和兽医学重要性。尽管治疗人巴贝斯虫病的一线药物阿托伐醌（atovaquone）靶向线粒体DNA编码的三个蛋白之一，但对核编码的线粒体蛋白质组的完整表征仍然缺乏。在此项研究中，研究人员结合细
巴贝斯虫属（Babesia）是一类由蜱传播的顶复门寄生虫，具有广泛的医学和兽医学重要性。尽管治疗人巴贝斯虫病的一线药物阿托伐醌（atovaquone）靶向线粒体DNA编码的三个蛋白之一，但对核编码的线粒体蛋白质组的完整表征仍然缺乏。在此项研究中，研究人员结合细胞器免疫沉淀和密度梯度分离技术，从巴贝斯虫分歧种（Babesia divergens）中富集线粒体。利用蛋白质质谱（protein mass spectrometry）和蛋白质相关性分析（protein correlation profiling, PCP），研究人员构建了高可信度的巴贝斯虫分歧种MitoCarta目录（BdMitoCarta），包含525个线粒体蛋白。该物种的线粒体蛋白质组在整个顶复门中广泛保守，而顶复门作为一个支系经历了还原性进化。与其他顶复门生物相似，其代谢物转运和三羧酸（TCA）循环发生了分化，表现为丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex）的缺失、苹果酸:醌氧化还原酶（malate:quinone oxidoreductase）的存在以及I类延胡索酸水合酶（class I fumarate hydratase）的出现。巴贝斯虫属特有的发现是其拥有两个线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）同源物。利用分离的线粒体，研究人员进行了蓝色原生凝胶电泳（blue native PAGE, BN-PAGE）复合物组分析，检测到先前未表征的蛋白与ATP合酶（ATP synthase）和线粒体核糖体（mitochondrial ribosome）共迁移。该项工作首次提供了巴贝斯虫属的线粒体蛋白质组和复合物组，预期将成为理解顶复门寄生虫进化以及未来治疗方法开发的宝贵资源。
研究背景与科学问题
线粒体在超过十亿年的真核生物进化中不断被重塑，这一过程在顶复门（Apicomplexa）中尤为显著。顶复门主要包括专性细胞内寄生原虫，如隐孢子虫（Cryptosporidium）、弓形虫（Toxoplasma）、疟原虫（Plasmodium）和巴贝斯虫（Babesia）。这些生物的线粒体生物学呈现出高度分化、精简化和属特异性的特征，反映了它们从寄生宿主中获取代谢物的能力。然而，由于顶复门生物通常仅含单个线粒体，且作为专性细胞内寄生虫，分离纯度高、完整性好的线粒体用于质谱分析面临巨大技术挑战。尽管已有研究通过超多重同位素标记的细胞器蛋白定位技术（hyperLOPIT）和邻近标记法分别鉴定了弓形虫和疟原虫的部分线粒体蛋白，但巴贝斯虫属的线粒体蛋白质组此前从未被系统研究过。考虑到线粒体是治疗人巴贝斯虫病一线药物阿托伐醌的作用靶点，且该病原体对全球畜牧业和公共卫生构成日益严重的威胁，全面解析其核编码的线粒体蛋白质组对于理解寄生虫进化、揭示新的药物靶点具有重要意义。
研究方法概述
研究人员首先构建了稳定表达3xHA-eGFP-BdTOM22融合蛋白的巴贝斯虫分歧种转基因株系，其中TOM22是线粒体外膜蛋白输入复合体的保守亚基。随后，采用机械过滤法裂解感染的红细胞以释放游离寄生虫，利用氮气空化法温和破碎寄生虫质膜释放细胞器，并结合抗GFP磁珠进行免疫沉淀富集线粒体（MitoIP）。富集的线粒体进一步通过OptiPrep密度梯度离心进行纯化，最终收集到两个梯度条带（B1和B2）。所有五个分级样品（全细胞、粗线粒体、MitoIP、B1和B2）均通过数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）进行分析。基于质谱获得的蛋白质丰度数据，研究人员采用蛋白质相关性分析（PCP），以TOM40、HSP60和ISCU三个高度保守的线粒体标志蛋白为基准，计算每个蛋白与标志蛋白的皮尔逊相关系数作为PCP评分，从而定义高置信度的线粒体蛋白目录。此外，还利用分离的线粒体进行了蓝色原生凝胶电泳（BN-PAGE）联合质谱的复合物组分析，分别在DDM和洋地黄皂苷两种去垢剂条件下解析蛋白复合物组成。
研究结果
1. 优化的实验流程成功富集巴贝斯虫分歧种线粒体
通过比较多种红细胞裂解方法，研究人员确定机械过滤是实现红细胞完全裂解和寄生虫释放的最佳方案。免疫印迹分析显示，线粒体外膜（MOM）、膜间隙（IMS）和基质标志蛋白在整个富集流程中同步升高，表明线粒体保持完整。质谱检测到3414个巴贝斯虫分歧种蛋白，占基因组注释蛋白总数的82%。以弓形虫亚细胞蛋白质组数据为参照，推定线粒体蛋白的信号占比从全细胞的7%逐步提升至MitoIP后的25%和密度梯度分离后的39%，证实了该富集方案的有效性。
2. 巴贝斯虫分歧种MitoCarta（BdMitoCarta）包含525个蛋白
基于PCP评分≥0.96的阈值，第一次生物学重复鉴定出520个线粒体蛋白（MitoViaPCP）。第二次独立重复实验的结果与第一次有95%的重叠，额外补充了5个经弓形虫hyperLOPIT数据佐证的蛋白，最终形成包含525个蛋白的BdMitoCarta目录。该目录的估计灵敏度为83%，校正后假发现率（cFDR）为13%。值得注意的是，三个线粒体DNA编码的蛋白（cox1、cox3和cob）均被成功检测并纳入目录，证明这三个基因仍在翻译成蛋白质产物。
3. 显微镜验证确认BdMitoCarta蛋白的线粒体定位
研究人员选取5个BdMitoCarta蛋白和4个文献基准“Gold+”线粒体蛋白进行免疫荧光显微分析。结果显示，LYRM4、BdIDHL和Bdiv_016970呈现明确的线粒体定位，BdIDH呈现线粒体和另一细胞器的双重定位，而LplA未能显示线粒体定位。对于4个PCP评分较低的Gold+蛋白（EngA、FtsH、KsgA1和TopoIII），均未观察到可信的线粒体定位，提示这些蛋白在巴贝斯虫中的定位可能不同于其在疟原虫中的定位。
4. BdMitoCarta在顶复门中高度保守
BdMitoCarta的525个蛋白映射到471个直系同源群（orthogroups, OGs）。这些OGs在巴贝斯虫近缘种中高度保守（B. bigemina 98%，B. microti 90%），并在致病性疟原虫和弓形虫中也有≥87%的保守率。相比之下，在已丢失线粒体DNA的隐孢子虫和簇虫（Gregarina）中，线粒体蛋白的保守率低于全蛋白质组背景水平。整合恶性疟原虫和弓形虫的hyperLOPIT数据发现，BdMitoCarta的灵敏度（83%）高于疟原虫（45%）和弓形虫（72%），但假发现率也相对较高。进化分析显示，52%的BdMitoCarta OG在原核生物中存在同源物，28%仅在SAR超类群中被检测到，其中大部分缺乏功能注释。
5. 巴贝斯虫分歧种线粒体蛋白质组高度精简
与线粒体树状生命计划（MitoTOL）中其他已表征的真核生物相比，巴贝斯虫分歧种拥有最小的真正线粒体蛋白质组。在803个被认为属于祖先线粒体的OGs中，66%（526个）在BdMitoCarta中缺失。与人类线粒体通路对比分析显示，巴贝斯虫分歧种可能已丢失或重新定位了涉及代谢、线粒体中心法则、氧化磷酸化（OXPHOS）和线粒体动力学的多条通路，包括电子传递链复合体I（CI）、线粒体DNA修复/稳定性酶、多数氨酰-tRNA合成酶、钙单向转运体和肉碱穿梭系统等。最保守的通路是铁硫簇生物合成、蛋白导入和分子伴侣介导的折叠。
6. 巴贝斯虫分歧种的代谢重塑证据
与其它顶复门生物一致，巴贝斯虫分歧种的代谢物转运和TCA循环与经典动物途径存在差异。研究人员在BdMitoCarta中鉴定出“Span I”TCA循环酶（柠檬酸合酶CS、乌头酸酶ACO、异柠檬酸脱氢酶IDH、酮戊二酸脱氢酶OGDH、琥珀酰辅酶A合成酶SCS和琥珀酸脱氢酶SDH），而“Span II”则包含苹果酸:醌氧化还原酶（MQO）替代苹果酸脱氢酶（MDH），以及含有铁硫簇的I类延胡索酸水合酶（FH）。值得注意的是，此前被注释为支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）的复合体实际上可能执行丙酮酸脱氢酶（PDH）的功能。
7. 巴贝斯虫分歧种拥有两个异柠檬酸脱氢酶同源物
BdMitoCarta意外地包含两个依赖NADP+的IDH同源物：BdIDH和BdIDHL。系统发育分析显示，BdIDHL及其在少数其他巴贝斯虫种中的同源物形成一个独特的进化支，位于真核生物IDH进化树的基部附近。AlphaFold3结构预测表明，BdIDHL的NADP+结合口袋因色氨酸残基的空间位阻而无法容纳辅因子。体外酶活实验证实BdIDH具有典型的NADP+依赖性IDH活性，而BdIDHL在任何测试条件下均无IDH活性，其功能尚待阐明。
8. 复合物组分析揭示14个线粒体复合体
通过BN-PAGE复合物组分析，研究人员在DDM和洋地黄皂苷两种去垢剂条件下鉴定了14个线粒体复合体中186个蛋白的共迁移模式，覆盖了OXPHOS复合体II、III、IV和V的全部亚基、线粒体核糖体大亚基（MRPL）和小亚基（MRPS）、以及BCKDH、OGDH和抑制素（prohibitin, PHB）等复合体。特别的是，复合体II和IV表现出相似的双峰迁移模式，提示可能存在CII:CIV超级复合体。这是首次在巴贝斯虫中通过BN-PAGE捕获并解析线粒体核糖体复合体。通过共迁移候选分析，研究人员鉴定出2个与CV共迁移的新蛋白、7个与MRPL共迁移的候选蛋白以及4个与MRPS共迁移的候选蛋白，其中部分可能代表巴贝斯虫属特有的新亚基或组装因子。
讨论与结论
该研究开发了一套从细胞内寄生虫中富集单个线粒体的实验流程，并利用蛋白质相关性分析定义了包含525个高置信度蛋白的BdMitoCarta目录，据研究人员所知，这是目前最全面的顶复门线粒体蛋白质组。该工作揭示了巴贝斯虫分歧种线粒体代谢的关键特征，包括TCA循环的非典型重构、两个IDH同源物的存在及其功能分化，以及通过复合物组分析发现的潜在新复合体组分。这些结果为理解顶复门寄生虫的线粒体进化提供了重要资源，也为开发针对巴贝斯虫病及其他顶复门病原体的新型疗法指明了方向。
