重组抗原联合检测山羊日本血吸虫病的ELISA诊断性能比较与评估：rSjCB1及rSjCB1+rSjSAP4混合抗原的应用潜力

《Microorganisms》：Comparison and Evaluation of Recombinant Antigens for ELISA-Based Diagnosis of Schistosoma japonicum Infection in Goats

为解决持续传播风险下山羊血吸虫病（caprine schistosomiasis）的诊断难题，本研究评估了四种重组抗原（rSjSAP4、rSj32、rSjCB1和rSj23）的诊断性能，并以可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen，SEA）作为参考对照。研究人员采用优化的间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测了来自特征明确的山羊血清样本组，包括94份实验感染日本血吸虫（Schistosoma japonicum）山羊的阳性样本和100份阴性样本。在评估的四种重组抗原中，rSjCB1显示出最高的敏感性（97.87%），而rSjSAP4表现出最高的特异性（98.00%）。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析得出rSjSAP4、rSjCB1、rSj32和rSj23的曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）值分别为0.8497、0.9895、0.8928和0.8050。含等浓度rSjCB1和rSjSAP4的混合抗原实现了均衡的性能（敏感性：93.62%，特异性：92.00%；AUC = 0.9472），并与参考标准具有极好的一致性（κ = 0.86）。综上所述，rSjCB1似乎是最有前景的单一诊断抗原，而rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合抗原可作为SEA的实用诊断替代方案，用于开发快速准确的山羊血吸虫病免疫检测方法。

山羊日本血吸虫病重组抗原ELISA诊断性能的系统比较与评估

一、研究背景与问题提出

血吸虫病是由血吸虫属（Schistosoma）吸虫引起的人畜共患寄生虫病，被列为被忽视的热带病。在中国，日本血吸虫（Schistosoma japonicum）是主要病原体，可感染包括人类、山羊、牛等家畜及野生动物在内的多种终末宿主。尽管我国血吸虫病传播已得到有效控制，但在部分湖沼地区仍面临保虫宿主管理困难和中间宿主钉螺控制难题，存在疫情复燃风险。近年来，流行区内山羊养殖规模快速扩大，其放牧习性增加了接触污染环境的概率，导致感染率较高。山羊与牛只混牧还易造成棘球绦虫等人兽共患寄生虫的混合感染，加重疾病负担。因此，亟需高灵敏度和高特异性的诊断方法用于山羊血吸虫病的检测。

传统粪便虫卵检查法劳动强度大、耗时长，不适合大规模筛查。血清学诊断技术因其高灵敏度和实用性受到关注，ELISA和免疫层析技术（ICTs）已广泛用于血吸虫病诊断和流行病学监测。目前中国山羊血吸虫病血清学诊断主要依赖SEA，但SEA制备繁琐、质量控制困难、抗原组成复杂。重组蛋白具有生产简便、易于标准化、组分明确等优势，因此有必要系统开发和评估基于重组蛋白的诊断方法。鉴于实验条件和人畜间种属差异，对候选诊断靶标进行系统比较评估至关重要。本研究选取了四种具有免疫诊断潜力的重组抗原——Sj23（四跨膜蛋白家族成员，表达于虫体被膜）、SjSAP4（新近鉴定的免疫诊断生物标志物）、Sj32（半胱氨酸蛋白酶，参与宿主血红蛋白消化和免疫逃逸）和SjCB1（组织蛋白酶，参与营养获取和宿主侵袭），系统评估其诊断山羊血吸虫病的性能。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过原核表达系统表达了重组Sj23、SjSAP4、Sj32和SjCB1蛋白，并以SEA为参照，采用ELISA评估这四种重组抗原对山羊血吸虫病的诊断性能。结果显示，rSjCB1敏感性最高（97.87%），rSjSAP4特异性最佳（98.00%）。ROC曲线分析表明rSjCB1的AUC值最大（0.9895），诊断性能最优。将rSjCB1和rSjSAP4等浓度混合后，检测性能更均衡（敏感性93.62%，特异性92.00%，AUC = 0.9472），且与参考结果的一致性达到几乎完美水平（κ = 0.86）。研究结论认为，rSjCB1是最有前景的单一诊断抗原，rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合抗原可作为SEA的实用替代方案，用于开发快速准确的山羊血吸虫病免疫检测方法。这一发现为山羊血吸虫病大规模流行病学筛查和消除计划监测提供了新的血清学工具。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：原核表达系统制备四种重组蛋白（rSjSAP4、rSj32、rSjCB1和rSj23）；Western blotting验证重组蛋白的抗原性；棋盘滴定法优化ELISA条件；比较HRP标记兔抗山羊IgG与HRP标记蛋白G两种二抗的检测性能并选择最优者；采用优化的间接ELISA检测血清样本。样本队列包括94份实验感染日本血吸虫山羊阳性血清（经尸检和虫体灌注及粪便毛蚴孵化试验确证）、100份来自山东威海非流行区农场山羊阴性血清、24份江苏南通健康羔羊标准阴性血清，以及9份捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）阳性血清用于交叉反应评估。

四、研究结果

4.1 重组蛋白的表达与纯化：四种重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，质粒测序验证插入序列正确。Western blotting以标准山羊阳性和阴性血清为一抗，每种重组蛋白均显示单一特异性条带，证明其具有良好的抗原性。

4.2 二抗比较：HRP标记蛋白G和HRP标记兔抗山羊IgG均能清晰区分阳性血清与阴性血清或健康羔羊血清。HRP标记蛋白G对阳性血清产生更高的OD₄₅₀值，降低假阴性风险，尽管某些抗原（特别是rSj32和rSj23）对阴性血清出现少量假阳性反应，但综合检测性能更优，故后续实验选用HRP标记蛋白G。

4.3 四种重组抗原和SEA的ELISA敏感性与特异性：rSjCB1敏感性最高（97.87%，95% CI: 92.53–99.74%），rSjSAP4特异性最佳（98.00%，95% CI: 92.96–99.76%）。rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合后，敏感性为93.62%，特异性为92.00%，性能更为均衡。

4.4 ROC曲线分析：rSjCB1的AUC最大（0.9895，95% CI: 0.9781–1.000），诊断性能最高；rSjSAP4和rSj32的AUC分别为0.8497和0.8928；rSj23和SEA的AUC较低，分别为0.8050和0.8312。rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合物的AUC为0.9472（95% CI: 0.9048–0.9897），高于SEA。约登指数方面，rSjCB1最高（0.9374），混合抗原次之（0.9049）。

4.5 一致性评价：rSjCB1的kappa值为0.78，与参考结果高度一致；rSj23和SEA的kappa值分别为0.42和0.48，为中度一致；rSjSAP4和rSj32的kappa值分别为0.38和0.37，一致性一般。rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合后kappa值升至0.86，达到几乎完美一致水平。

4.6 交叉反应性：用9份捻转血矛线虫阳性血清进行交叉反应评估，四种重组抗原均在1–2份样本中产生弱阳性反应，而SEA未出现阳性反应。

五、讨论与结论

讨论部分指出，传统寄生虫学检查方法在低强度感染中敏感性显著降低，且不适用于大规模现场监测。重组蛋白ELISA已被证明是可靠的替代方案。本研究选取的四种抗原基于其在鼠和牛模型中的强体液免疫反应。SjSAP4在本研究中敏感性较低但特异性极高；rSj32虽对阳性血清产生高吸光度值和高敏感性，但对阴性样本产生不可接受的假阳性率，特异性显著降低，可能不适用于山羊血清抗体检测；rSjCB1作为组织蛋白酶B，在寄生虫全部发育阶段表达，具有良好的免疫原性和抗原性，本研究证实其具有高诊断潜力；rSj23在山羊中的表现与在人血吸虫病中的低敏感性模式一致，提示同一抗原的诊断性能在不同宿主物种间存在差异，强调了跨宿主物种评估重组抗原的重要性。

研究人员特别讨论了rSjCB1与rSjSAP4混合抗原的协同机制：SjCB1与早期组织侵袭相关，SjSAP4表达于成虫肠道阶段，二者可捕获不同阶段的抗体反应，其多样化表位有助于减轻宿主间免疫变异性。SjCB1提供强免疫反应性，SjSAP4通过减少交叉反应假阳性增强特异性。多抗原组合策略在牛布鲁氏菌病等兽医血清学诊断中已有成功应用先例。

关于cut-off值设定，研究人员参考了健康羔羊血清OD₄₅₀均值加三倍标准差的方法，并补充了ROC曲线推导的最佳cut-off值作为补充分析，不同标准未改变研究总体结果和结论。交叉反应评估方面，研究仅纳入捻转血矛线虫阳性血清，未来应扩展至片形吸虫、毛圆线虫、莫尼茨绦虫和艾美耳球虫等其他常见山羊寄生虫。此外，实验感染采用统一剂量（300条尾蚴），可能产生相对一致的抗体谱，而自然感染中虫荷、寄生虫发育阶段和合并感染情况各异，可能影响抗原诊断性能。

研究结论指出，rSjCB1对山羊血吸虫病检测具有高诊断潜力，rSjCB1与rSjSAP4等浓度混合抗原也展现出显著诊断价值。二者均可用于山羊日本血吸虫感染的检测和筛查，但在广泛应用前需进一步开展现场验证。基于抗体的血清学方法无法区分活动性感染与既往暴露，因此这些抗原主要推荐用于大规模流行病学筛查和消除计划监测，而非早期急性诊断或个体治疗评估。未来研究可考虑纳入循环抗原标志物（如CCA或CAA）或核酸标志物以更好区分活动性感染。